代谢控制发酵内部 资料

限量补充培养法：将经适当稀释的浓缩处理液涂布于含有微量蛋白胨或0.1%完全培养基成分的基本培养基平板上。经培养后，野生型细胞迅速生长成较大菌落，而缺陷型细胞生长缓慢只能形成小菌落。这些小菌落大多数为营养缺陷型，将其转接到完全培养基斜面保存待测。

平衡合成：底物A 经分支合成途径生成两种终产物E 与G ，由于a 酶活性远大于酶b , 结果优先合成E 。E 过量后就会抑制a 酶，使代谢转向合成G 。G 过量后，就会拮抗或逆转E 的反馈抑制作用，结果代谢流又合成E ，如此循环。

优先合成：底物A 经分支合成途径生成两种终产物E 与G ，由于a 酶活性远大于酶b , 结果优先合成E 。E 过量后就会抑制a 酶，使代谢转向合成G 。G 合成达到一定浓度时就会对c 酶产生抑制作用。

转导：利用转导噬菌体为媒介而将供体菌的部分DNA 导入受体菌中，从而使受体菌获得部分遗传性状的现象。 反馈阻遏：即在合成过程中有生物合成途径的终点产物对该途径的一系列酶的量调节, 所引起的阻遏作用。反馈阻遏是转录水平的调节, 产生效应慢。

基本培养基：能满足野生型或原养型菌株的最低营养成分的培养基。

代谢控制发酵：利用遗传学的方法或其他生物化学的方法，人为地在DNA 分子水平上，改变和控制微生物的代谢，使有用目的产物大量生成、积累的发酵。

脱敏作用:变构酶经特定处理后，不丧失酶活性而失去对变构效应物的敏感性。（方法：汞盐、PCMB 处理、0—5低温、冷水、尿素、蛋白酶）

分解代谢物阻遏：当细胞具有一优先利用的底物时，很多其他分解反应途径受到阻遏。

营养缺陷型：指原菌株发生基因突变，致使合成途经中某一步骤发生缺陷，从而丧失了合成某些物质的能力，必须在培养中外源补加该营养物质才能生长的突变型菌株。 渗漏缺陷型：遗传性障碍不完全的缺陷性。

代谢互锁：从生物合成途径来看，似乎是受一种完全无关的终产物控制，它只在较高浓度下发生，而且这种抑制作用是部分性的、不完全的。

与补救途径有关的酶：核苷磷酸化酶、核苷酸焦磷酸化酶、核苷酸磷酸激酶。

糖酵解（EMP 途径）关键酶：葡萄糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶。

代谢工程的具体思路：1、改变代谢流：①加速速度限制反应②改变分支代谢途径的流向③构建代谢旁路④改变能量代谢途径。2、扩展代谢途径和构建新的代谢途径：①引入外源基因，延伸代谢途径②利用新的底物，构建新的生物合成途径。

反馈抑制的调节类型可以分为以下几种：（1）单功能途径中酶活性的调节类型：①前体激活，②补偿性激活。（2）多功能途径中酶活性的调节类型：①协作反馈抑制或称多价反馈抑制②合作反馈抑制③积累反馈抑制④顺序反馈抑制⑤假反馈抑制：指结构类似物的反馈抑制⑥同功酶

代谢控制发酵的基本思想：⑴切断支路代谢：①选育营养缺陷型突变株，②选育渗漏缺陷突变株。⑵解除菌体自身的反馈调节：①选育抗类似物突变株②酶活性的利用③营养缺陷型回复突变株的应用。⑶增加前体物的合成

⑷去除终产物⑸特殊调节机制的利用：①多种产物控制机制的利用②平衡合成的利用③代谢互锁的利用④优先合成的变换。⑹条件突变株的应用⑺选育不生成副产物的菌株⑻选育生产代谢拮抗物质的菌株

诱变育种中的几个问题① 出发菌株的选择：⑴出发菌株对诱变剂的效应，⑵染色体组倍数对诱变剂的效应。② 细胞悬浮液的制备：⑴同步培养，⑵菌龄，⑶细胞悬浮液浓度，⑷细胞悬浮液的制备。③ 诱变剂的选择及处理方法的选择：⑴诱变剂的选择，⑵诱变剂量的选择，⑶诱变剂处理方法的选择。④ 中间培养

细胞膜渗透性代谢控制分类：（1）通过控制基因的酶生物合成的控制机制。（诱导—促进酶的合成；阻遏—抑制酶的合成 。阻遏包括终产物阻遏和分解代谢物阻遏。）（2）酶活性的控制。（终产物抑制或激活、通过辅酶水平的活性调节、酶元的活化、潜在酶的活化）（3）通过细胞渗透性的控制（调节酶—变构酶同功酶多功能酶、静态酶、潜在酶）

代谢产物大量积累措施：①应用营养缺陷性菌株②选育抗反馈调节突变株③选育细胞膜通透性突变株④利用营养缺陷性回复突变株或条件突变株的方法⑤构建目的工程菌株⑥环境控制机表面活性剂的使用。

营养缺陷型的浓缩：①青霉素法②D-环丝氨酸法③五氯酚法④亚硫酸法⑤制霉菌素法⑥2-脱氧葡萄糖法⑦过滤法⑧差别杀菌法

营养缺陷型的检出：①逐个检出法:②夹层培养法③限量补充培养法④影印接种法

原生质体融合育种步骤：①标记菌株的筛选②原生质体的制备③原生质体的再生④原生质体的融合⑤融合子的选择 ⑥实用性菌株的筛选

原生质体的制备影响因素：⑴菌体的前处理，⑵菌体的培养时间（一般选择对数生长期的菌体），⑶酶浓度，⑷酶解温度（一般控制在20-40℃），⑸酶解时间，⑹渗透压稳定剂

1、D-核糖发酵的代谢控制育种：

① 出发菌株的选择，② 转酮酶缺陷突变株的分离：⑴选育不利用D-葡萄糖酸或L-阿拉伯糖的突变株，⑵选育莽草酸缺陷突变株，⑶选育L-色氨酸缺陷、L-酪氨酸缺陷、L-苯丙氨酸缺陷、CoQ 缺陷、维生素K 缺陷或叶酸缺陷突变株。③ 其他标记，④ 利用基因工程技术构建核糖工程菌株，⑤ 发酵控制。

2、γ-亚麻酸发酵的代谢控制育种思路：① 出发菌株的选择，② 切断或减弱支路代谢，③ 解除反馈调节，④ 强化能量代谢，⑤ 增强前体物的合成，⑥ 选育Δ6-脱氢酶活力强的突变株，⑦ 选育低温生长突变株，⑧ 选育耐高糖的突变株。

3、赖氨酸发酵：① 切断或减弱支路代谢，② 解除反馈调节，③ 解除代谢互锁，④ 改善膜的通透性，⑤ 增加前体物的合成，⑥ 选育温度敏感突变株，⑦ 选育脲酶回复突变株，⑧ 利用基因工程技术构建赖氨酸工程菌株

4、谷氨酸发酵：① 切断或减弱支路代谢，② 解除自身反馈调节，③ 增加前体物，④ 提高细胞膜的渗透性⑤ 选育强化能量代谢的突变株⑥ 其他遗传标记⑦利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌株。

5、色氨酸发酵：① 切断支路代谢，② 解除自身反馈调节，③ 增加前体物，④ 切断进一步代谢，⑤ 利用基因工程技术构建色氨酸工程菌株，⑥ 其他标记。⑦利用细胞融合或转导的方法进行遗传重组可使产量提高。

6、肌苷发酵的代谢控制育种：① 出发菌株的选择，② 增加前体物质，③ 切断支路代谢：⑴选育Ade －菌株，⑵选育Xan －或Gu －菌株，⑶选育Thi －或His －菌株，⑷选育核苷磷酸化酶弱的菌株。④ 解除菌体自身的反馈调节：⑴选育抗腺嘌呤及鸟嘌呤结构类似物突变株，如8-氮腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤等抗性突变株，⑵选育抗腺嘌呤或黄嘌呤的突变株，⑶选育抗磺胺类药物突变株，如磺胺嘧啶、磺胺哒嗪抗性突变株。