MS培养基及配制注意事项
一、MS 培养基母液的配制
注意:1.大量元素按照使用时高10倍的数值称取,分别将各种化合物称量后,除CaCl 2·2H 2O 单独配制外,其余化合物混合在500ml 烧杯中加适量蒸馏水溶解,用玻璃棒搅拌促溶,倒入1000ml 容量瓶中用蒸馏水定容至刻度,置小口瓶中保存,贴上标签注明化合物名称(或编号),浓缩倍数,配制日期和配制者姓名,CaCl 2·2H 2O 配制同上置于另一小口瓶中。
2.微量元素母液的配制
按要求浓缩100倍的数值称取,分别将各种化合物称量除铁盐(FeSO 4·7H 2O 和Na 2-EDTA.2H 2O )作为一组单独配制外,其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后,定容在1000ml 容量瓶中,置小口瓶中保存,贴上标签。 3.铁盐配制将FeSO 4·7H 2O 和Na 2-EDTA.2H 2O 分别溶于450ml 蒸馏水中,加热,(很重要)不断搅拌,溶解后,两液混合,调PH 至5.5加水定容至1000ml ,置于小口瓶中,贴上标签。
4.有机物母液配制,按母液要求浓缩50倍,除蔗糖按3%单独临时称量外,其余分别称量后,溶解,定容在500ml 容量瓶中,置于小口瓶中保存,贴上标签。 5.母液最好在2~4℃的冰箱中贮存,特别是有机类物质,贮存时间不宜过长,无机盐母液最好在一个月内用完,如发现有霉菌和沉淀产生,就不能再使用。 1.制备母液和营养培养基时,所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求,化学药品必须是高纯度的(分析纯)。
2.称量药物采用高灵敏度的天平,每种药品专用一药匙。 .生长调节剂母液配制:
为了操作方便,节约时间,生长调节剂也可如同配制母液一样,先配成原液,这样配制培养基时只要稍加计算,按需要量取即可。
不同药品在配制时若不溶于水,可用少量不同的溶剂先溶解,萘乙酸(NAA ),吲哚乙酸(IAA ), 赤霉素(GA 3),2,4-D 等生长素和玉米素(ZT )可先用少量95%酒精溶解,然后加水,如溶解不完全再加热。激动素(KT )和6-苄基嘌呤(BA )可溶于少量1mol/L的盐酸中,叶酸需用少量稀氨水溶解。
称取50mg 生长调节物质,溶解后,在100ml 的容量瓶中定容,配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg ,配制后一般要求在低温(0~4℃)保存,配制培养基时如每升(1000ml )需添加的生长调节剂物质为0.5mg 时,则取1ml 母液即可。
二、培养基配制和灭菌
一.养培养基配制程序
(一). 母液吸取量的计算
配制培养基的升数
公式1:母液吸取量= 母液体积(CC )×——————————
母液浓缩倍数
培养基要求的含量
公式2:母液吸取量= ———————————(各种生长调节剂)
母液每CC 的含量
(二) 各种母液按顺序编号排列
A. 大量元素;B.CaCl 2.2H 2O ; C. 微量元素 ;D. 铁盐; E. 有机物; F .生长素萘乙酸(NAA ):配制0.5mg/ml的NAA 称取50mg , NAA用少量95% 酒精溶解后加蒸馏水定容至1000ml ;G . . 细胞分裂素、激动素(KT )配制0.5mg/ml的KT 称50mgKT 用少量1N HCL溶解后, 加蒸馏水定容至100ml 。 (三) 配制培养基(1000ml )
1. 琼脂: 称取5~7g琼脂,加入300ml 蒸馏水,加热溶解直至完全溶解为止. 2. 蔗糖3%用质量较好的白糖代替,称取30g 白糖,溶于溶有琼脂的300ml
蒸馏水中。
3. 各种母液的吸取(培养基1L )
(1) 用50ml 量筒量取大量元素母液(A )和CaCl 2·2H 2O 母液(B )各
100ml
(2) 分别用10ml 移液管或吸管吸取微量元素(C ),铁盐(D )母液各
10ml
(3) 用10ml 移液管或吸管吸取有机物(H )10ml (4) 移取激素
将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中,混合均匀后,加热至80℃左右,用酸度计或精密PH 试纸测定培养基的PH 一般要求5.8~6.0,过酸过碱则用1N NaoH 和1N HCL调整。
二.分装:用一个接有胶管的分装器趁热装培养基,1000ml 培养基分装到25-30个三角瓶中,每个三角瓶约30ml 左右(一般占试管、三角瓶容量1/4~1/3左右)注:培养基勿碰瓶壁。
三. 包装:分装好的三角瓶用封口膜包扎好,标明培养基代号即可进行灭菌。 用具清理和洗涤:各种母液按原位置摆整齐,用过的量筒,移液管、烧杯、
铝锅等用水洗涤干净,然后按次序放回原处。
三、高压蒸汽灭菌锅的使用方法
具体操作步骤:
1. 高压锅放水至平把架; 2. 把包扎好的培养基装入高压锅;
3. 盖上热压锅盖, 上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽) 关上气阀和安全阀. 4. 然后接通电源.
5. 压力计升至0.05MPa 时,打开放气阀, 排除冷空气(此步很重要) 。
6. 排除冷空气后, 关闭放气阀,待压力升到0.11MPa 位置时,开始计算灭菌时间,具体方法:当压力锅指针升至0.12MPa 时,关闭电源,待指针下降至0.11MPa 时接通电源,不断重复此操作过程,维持20分钟。
7. 灭菌时间达到20分钟后,除去电源,打开放气阀(注意要逐渐放气) 待高压锅内的空气完全排除后,打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽) 稍待冷后再把培养基取出。
8. 经过灭菌的营养培养基不宜放置太长,应尽早使用,但为了在使用前能检查培养基有无微生物污染,可将培养基置于25℃下保存4天,如果培养基需要贮存较长时间,可在4℃低温下保存。
灭菌高压锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多种型号和规格,无论哪种型号,操作的步骤都很相近。
进水→放进培养基→盖紧锅盖→关上放汽阀→检查安全阀→接上加热源→待压力升至0.05MPa 时排锅内冷空气,关上放气阀→0.11MPa(121℃) 下灭菌20~25分钟,保持稳定压力→除热源→逐渐打开放气阀→锅内空气排除完后→开放锅盖→稍冷后取出培养基。
四、无菌操作技术
(一)植物材料表面——消毒剂灭菌
从外界或室内选取的植物材料,都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基,便会造成培养基污染。因此,植物材料必须经严格的表面灭菌处理,再经无菌操作手续接到培养基上,这一过程叫做接种。
1. 接种步骤:
第一步:清理材料→→流水冲洗→→加入吐温(或洗衣粉)清洗 →→自来水冲洗
第二步:对材料的表面浸润灭菌 : 70%酒精浸10-30秒→→无菌水 第三步:灭菌剂处理→→ 0.1-1%升汞5-8 min(或其他灭菌剂) 第四步:无菌水进行冲洗 注意事项:
1. 灭菌剂一般要临时配制,现配现用.升汞可以短期储存.
2. 对去除较容易的灭菌剂灭菌后无菌水冲洗3-4次,升汞一般5-8次,每次不少于3min
3. 灭菌时要轻轻的搅拌,消除气泡,使消毒更彻底.
4. 灭菌时间是从倒入消毒液开始,至倒入无菌水时为止。 5. 灭菌液要充分浸没材料
2. 无菌操作可按以下步骤进行:
(1)在接种3天前用甲醛熏蒸接种室,并于接种前3小时打开其内紫外线灯进行杀菌;
(2)在接种前20分钟,打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯; (3)接种员先洗净双手,在缓冲间换好专用实验服,并换穿拖鞋等;
(4)上工作台后,用酒精棉球搽拭双手,特别是指甲处。然后搽拭工作台面; (5)先用酒精棉球搽拭接种工具,再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍,然后反复过火尖端处,对培养皿要过火烤干;
(6)接种时,接种员双手不能离开工作台,不能说话、走动和咳嗽等; 材料吸干后,一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀,对材料进行适当的切割。(如
2
叶片切成0.5cm 的小块;茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1-2片叶原基)在接种过程中要经常灼烧接种器械,防止交叉污染。
(7)接种完毕后要清理干净工作台,可用紫外线灯灭菌30分钟,若连续接种,每5天要大强度灭菌一次。
常用植物激素
四、常用药品的配置方法
1. 1mol/L HCl的配制:根据盐酸的密度37%盐酸溶液的密度为1.19克/毫升,假设要配制1000ml 1mol/L HCl ,则需要盐酸的物质的量为1mol ,所以需要量取37%的盐酸为1*36.5/37%/1.19=82ml
2. 1mol/L的NaOH 的配制:称40gNaOH ,然后融于1000ml 的蒸馏水中。(定容到100ml )
3. 95%的酒精配制成75%的酒精:用量筒量取750ml 的95%酒精加入200ml 的蒸馏水即可得到75%的酒精。
如果用无水酒精配制75%的酒精,则量取750ml 的无水酒精,再加水250ml 。 4. 0.1%的升汞配制:先称取1克升汞粉末,然后用蒸馏水溶解最后定容到1000ml 。 5. 1mg/ml的2.4-D 的配制:称取0.1g2.4-D ,用少量1mol/LnaOH或酒精助溶,然后定容到100ml 。
6.1 mg/ml的6-BA 的配制:称取0.1g6-BA ,用少量1mol/L HCl或1mol/LNaOH助溶,然后定容到100ml 。
7.0.5mg/ml的NAA 的配制:称取0.05gNAA ,用少量95%酒精助溶,然后定容到100ml 。