干细胞在眼科领域的研究及应用前景
干细胞在眼科领域的研究及应用前景
一、干细胞的基本概念及研究前景
干细胞（stem cells ）是指具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的一类未分化细胞，主要分为两大类：一类是胚胎组织来源，可以分化为三个胚层的各种细胞，如胚胎干细胞(embryonic stem cells ，ESCs ) ；另一类是源于成体组织，能够产生所在特定组织的各种细胞，称为成体干细胞，如骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal stem cells，BMSCs ）、神经干细胞（neural stem cells，NSCs ）、视网膜干细胞以及角膜缘干细胞（Limbal stem cells ）等。
自从1998年12月美国科学家在《Science 》杂志上报道他们成功地在体外培养和增殖了人体胚胎干细胞以来，有关干细胞的研究得到广泛开展和迅速发展。而干细胞与组织工程学的结合标志着一场深远的医学革命，即再生医学时代的到来。科学家认为，干细胞及其衍生物组织器官的临床应用，是人类在21世纪的最大科技成果之一，必将产生一种全新的治疗技术，是对传统医疗手段和医疗观念的一场革命。2004年4月《Science 》杂志陆续报道了日本学者在世界上第一次完成了哺乳动物的单雌生殖（fatherless ），将两个不同卵细胞的遗传物质进行组合培育出健康的小鼠；韩国学者则利用“体细胞核转移”，（SCNT ）技术完成了人胚胎干细胞建系；干细胞相关研究在我国也处于快速发展阶段，已经取得了一些国际水平的研究成果。干细胞已经广泛应用于细胞治疗，组织构建，发育生物学研究，疾病自然动物模型的制作等方面，为临床上难治性眼病的治疗提供了一条希望之路。
二、干细胞在眼科中的应用
目前，眼科学发展存在几个核心问题：眼发育生物学；眼表损伤的修复与重建；遗传性眼病致病基因的筛选和功能研究；自然眼病动物模型的构建；视功能损害的保护和再生等。迅速发展的干细胞与再生医学研究，则可能从根本上解决上述问题。干细胞已经在下述眼科领域中取得长足进展。
1. 利用干细胞进行眼表重建及生物角膜构建
利用干细胞移植治疗临床上角膜缘干细胞缺陷症，恢复了眼表的完整性和透明性。利用组织工程学原理构建生物角膜是解决角膜移植供体来源匮乏的有
效途径。我们的研究表明胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞和皮肤干细胞可以诱导成角膜缘干细胞（表现干细胞增殖分化特征，且AE5、P63阳性）以作为构建的种子细胞，同时通过比较四种载体材料－聚乳酸与聚羟基乙酸的共聚物（PLGA ）、羊膜、板层角膜切削刀（MLK ）加工的异种角膜基质、对苯二甲酸乙二醇酯（PET ）的构建效果，表明PET 膜可以作为体外构建复层角膜上皮较为理想的支架，而经过MLK 切削的异种角膜基质具有厚度可控，表面光滑、透明，强度适中，免疫原性低，利于神经再生等优点更适合体内板层生物角膜的组装。新近发展的Minucell 灌注培养系统与传统的细胞培养池和转瓶培养系统相比，构建条件更加稳定，上皮细胞复层形成更好，上皮层与载体材料之间结合更紧密，并且操作简单，有利于生物角膜的产业化构建。
2. 视神经的保护和再生研究
干细胞在青光眼等视网膜视神经变性性疾病中的应用研究主要包括：1. 建立了微创性视网膜下腔移植和绿色荧光蛋白（GFP ）标记干细胞技术。可以对眼内移植干细胞的分化和迁移进行追踪和监测；2. 实现了诱导ESCs 向视网膜谱系定向分化，并在体外获得中间阶段的干细胞（即视网膜样干细胞）的实验技术。用体外培养视网膜细胞、雪旺氏细胞、M üller 细胞结合视黄酸（RA ）对ESCs 或体外胚胎体EB 进行诱导，通过NSCs 无血清培养基筛选、富集，可以得到表达Pax6、Nestin 、S100、GFAP 、GAP43、Synaptophysin 、Thy1.1和MAP2等抗原的神经干细胞和视网膜样细胞；3. 实现了由成体干细胞直接向神经干细胞和视网膜细胞分化的诱导体系。骨髓间充质干细胞可以在雪旺氏细胞、新生乳鼠的视网膜细胞及神经营养因子NGF/BDNF诱导下，分化的细胞表达视网膜细胞的标志蛋白；带GFP 标记的海马神经前体细胞在移植入视网膜短暂缺血再灌注的大鼠视网膜下腔后，能够向损伤部分迁移、修复受损细胞，细胞表达视网膜视神经的标记，其轴突向视神经方向延伸，初步显示出整合的潜能，为进一步探索视网膜视神经再生提供了新的有价值、有前途的研究方向。
3．应用干细胞技术进行基因打靶，构建自然眼病动物模型
尽管自然界中存在着原发性眼病动物例如兔、狗，但其发生率低，死亡率高，来源非常有限。因此目前广泛应用于眼科临床基础研究的眼病动物模型均为试验性、继发性动物模型，需要强调的是这种动物模型不属于原发性疾病的
自然模型，不能解释原发性眼病发生的始动原因，也无法完全模拟其发生的自然病程，造成结果的偏差。
1984年，Bradley 通过显微注射成功将ES 细胞引入小鼠囊胚，并证实ES 细胞可分化为成体的各种组织并整合进入生殖系，代表着ES 细胞技术发展过程中的重要里程碑。随后，在此基础上发展起来的基因打靶技术使得在生物整体水平上定向改变和修饰哺乳动物的染色体变为可能，成为“后基因组”时代功能基因组学研究的重要平台技术；更值得注意的是，由于许多人类遗传病都是由单个基因的突变引起的，因此应用基因打靶技术在小鼠或其它哺乳类动物基因组中引入精细突变，就可以研制出精确模仿人类疾病的自然动物模型。
在眼科学界，已发现许多眼病相关基因突变，但多数基因与疾病之间的直接因果关联尚未得到证实，需在动物水平对这些相关基因突变的功能进行研究，进而模拟疾病的自然发生过程。2002年，我国学者将先天性白内障的致病基因定位于16号染色体上的HSF-4基因，首次将热休克蛋白与白内障的发生联系起来，相关研究结果发表在《Nature Genetics 》上，这是中国眼科界发表在国际医学领域最高IF 分值杂志上的第一篇论文，是标志性成果，具有里程碑意义，但是其候选致病基因HSF-4的功能及其与白内障之间的关系有待于进一步研究。
1999年国内首先报道了一个五代人的完整开角型青光眼家系（GZ.1家系），该家系共5代人，58名成员，其中21名开角型青光眼患者，经过数年追踪，通过全基因组扫描、连锁分析将候选基因定位于1号染色体的GLC1A 位点；在此范围内利用基因筛查手段，证实家系全部POAG 患者TIGR/MYOC基因第370密码子脯氨酸被亮氨酸所替代（Pro370Leu ）；进一步应用基因转染手段在体外培养的小梁细胞中观察发现Pro370Leu 突变型TIGR/MYOC蛋白在小梁细胞内以难以分泌的积聚体形式存在，并产生一定细胞毒性，导致细胞骨架、细胞粘附、迁移功能异常。从已有研究结果分析，Pro370Leu 突变对于GZ.1家系青光眼的发生起到关键的作用。但生理条件下TIGR/MYOC基因的生物功能如何？TIGR/MYOC基因突变与开角型青光眼的发生是否存在必然联系？如何阐明突变TIGR/MYOC基因致POAG 发生的确切机制？针对这些问题，国内课题组正在进行青光眼相关基因（TIGR/MYOC基因）时空特异性基
因打靶研究，如进展顺利，不仅可以阐明基因突变在POAG 发病中的作用，更有深远的意义是该模型的构建将弥补现存实验性青光眼动物模型的缺陷，为POAG 的研究提供其他手段所无法比拟的优质实验平台，推动POAG 相关基因功能、发病机制以及有效的治疗措施等的研究进展。
此外，目前绝大多数模型是建立于啮齿类动物基础之上，其研究结果无法直接应用于人类或可能导致理解的偏差和误导。1995年，Thomson 等从恒河猴中分离了猴的胚胎干细胞，这些细胞可以在体外培养一年以上并维持未分化的状态，并保持分化成各胚层组织细胞的能力。灵长类胚胎干细胞的成功分离与基因打靶技术相结合，使得构建灵长类动物自然模型成为可能，这将是模拟人类疾病自然进程最理想的动物模型。
三、干细胞研究中亟待正视与解决的关键问题
虽然干细胞的研究近几年得到迅速的发展，但仍有大量的问题要我们冷静、客观、审慎对待，其中包括：1. 建立系统的技术平台，包括核心技术、设备、人才及研究经验的积累，以及在干细胞领域凝练核心问题的能力；2. 干细胞诱导、分化以及横向分化（Transdifferentiation ）的调控机制问题。只有明确这些调控机制，才能稳定地将干细胞诱导分化为我们需要的特定发育阶段和组织细胞类型；3. 成体干细胞的特异性标志筛选以及分离提纯问题；4. 干细胞的致瘤性与免疫源性问题；5. 干细胞移植的“获能”问题。干细胞必须被特定受体组织接受，发生结构和功能的整合，这是目前尚未解决的关键问题之一；6. 组织工程化角膜构建过程中角膜内皮仍然是一个难以逾越的障碍，全角膜的构建还有较长的路要走；7. 干细胞研究还涉及伦理学问题，这有待立法和规范化的监督机制。