1.PCR的技术的主要步骤:
1、PCR 的技术的主要步骤：
①DNA 变性：（90℃-96℃）：双链DNA 模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA
②退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA 模板结合，形成局部双链。
③延伸：（70℃-75℃）：在Taq 酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP 为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA 链。
每一循环经过变性、退火和延伸，DNA 含量即增加一倍。如图所示：现在有些PCR 因为扩增区很短，即使Taq 酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。
①引物长度：15-30bp, 常用为20bp 左右.
②引物扩增跨度：以200-500bp 为宜, 特定条件下可扩增长至10kb 的片段.
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带.ATGC 最好随机分布, 避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列.
④避免引物内部出现二级结构, 避免两条引物间互补, 特别是3' 端的互补引物引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，, 否则会形成引物二聚体, 产生非特异的扩增条带.
⑤引物3' 端的碱基, 特别是最末及倒数第二个碱基, 应严格要求配对, 以避免因末端碱基不配对而导致PCR 失败.
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处.
⑦引物的特异性：与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性. 引物量：每条引物的浓度0.1umol 或10～100pmol, 以最低引物量产生所需要的结果为好, 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增, 且可增加引物之间形成二聚体的机会.
④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠
质粒的特征：
①质粒具有自我复制的能力。
②质粒DNA 所编码的基因产物赋予细菌某些性状特征。 ③质粒可自行丢失与消除。
④质粒的转移性。
⑤质粒可分为相容性与不相容性
LacZ蓝白斑筛选原理：Ampicillin 抗性和 lacZ的a 肽互补（蓝白斑）相结合。
无质粒的受体菌，无菌斑生长；质粒转化的受体菌，有蓝色菌斑生；带外源DNA 插入的质粒转化的受体菌，有白色菌斑生长。
a) b-半乳糖苷酶和Xgal 会发生显色反应：b-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal 分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。半乳糖和5-溴-4-氯靛蓝lacZ 的a 肽互补。（pUC 质粒载体上的lacZ’ 编码a 肽与这个缺失突变的b-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解Xgal 。产生蓝色物质。 b） 插入外源基因后由于a 肽互补失活，不产生蓝色反应。pUC a互补的插入失活载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。不能互补。