酱油二次沉淀蛋白质的分离
酱油二次沉淀蛋白质的分离、鉴定及氨基酸分析
孙鹏飞，高献礼,闫 爽，陆 健
( 江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡 江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 江南大学生物工程学院，江苏无锡 宿迁市江南大学产业技术研究院)
摘 要: 以酱油上清液中可溶性蛋白质为对照，以静置－真空冷冻干燥法制备酱油二次沉淀，采用 N－三( 羟甲基) 甘氨酸－十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳( Tricine－SDS－PAGE) 、基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱(
MALDI－ TOF / TOF MS) 和高效液相色谱( HPLC) 法对比研究了酱油二次沉淀蛋白质的分子量分布、氨基酸组成特征和蛋白质的疏水性，并对酱油二次沉淀蛋白质进行了分子鉴定。结果表明: 酱油二次沉淀蛋白质由分子量约为 22.7ku( 80.20% ) 和 34.1ku( 19.80% ) 的蛋白质组成，质谱鉴定结果证实前者为大豆球蛋白( Glycinin) G4 亚基碱性端 B3，后者为大豆球蛋白( Glycinin) G1 酸性端 A1a。氨基酸组成分析表明酱油二次沉淀蛋白质与酱油上清蛋白质氨基酸组成存 在一定差异，酱油二次沉淀蛋白质的疏水性明显高于酱油上清蛋白质。本研究进一步深化了对酱油二次沉淀蛋白质的认识，为酱油二次沉淀问题的解决提供了新的依据。
关键词: 酱油，二次沉淀，蛋白质鉴定，氨基酸分析
目前，国内学者和本实验的前期工作主要研究了酱油二次沉淀的主要成分、 影响其形成的因素及我国酱油二次沉淀含量的分布［2－6］。日本学者对引起酱油二次沉淀的促进因子和引起酱油热凝集作用的酶分别进行了分离和鉴定［7－9］。由以上研究可知，目前国内外对二次沉淀的研究尚停留在常规指标分析和影响其形成因素的分析上，而对组成酱油二次沉淀蛋白质的质量分布、蛋白质来源及蛋白质氨基酸组成特征等信息的研究尚未见报道。
蛋白质被认为是引起酱油二次沉淀形成的关键因素，而深入了解酱油二次沉淀蛋白质的来源和氨基酸组成特征对解决酱油二次沉淀问题尤为重要［3－6］。因此本实验通过 N－三( 羟甲基) 甘氨酸－十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳( Tricine－SDS－PAGE) 和高效液相色谱 ( HPLC) 技术对酱油二次沉淀中的主要成分蛋白质进行分析，并通过基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱( MALDI－
TOF/TOFMS) 技术追溯蛋白质的来源，以期对其中蛋白质有更深入的认识，为酱油二次沉淀问题的解决提供新的依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
酱油 购于江苏无锡华润万家超市，主要酿造原料为脱脂大豆、小麦、食盐，高盐稀态酿造，氨基酸态氮≥0.4g /100m L，食品添加剂有焦糖色、谷氨酸钠、苯甲酸钠、对羟基苯甲酸乙酯、黄原胶，产地北京，生产日期为 2012.5.31; Tricine 和蛋白质标准品( 分子量 4.1 ～ 45.0ku) 上海生工生物工程公司;NH4HCO3、二硫苏糖醇( DTT) 、碘乙酰胺( IAA) 、三氟乙酸( TFA) 美国 Sigma 公司; 其他试剂 均为分析纯。
垂直电泳仪 美国 Bio－Ｒad 公司; Ultraflextreme飞行时间串联质谱仪 德国 Bruker 公 司; Agilent1100 型氨基酸专用高效液相色谱仪 美国安捷伦公司; H1850Ｒ 型台式高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司; QT 漩涡混合器 上海琪特分析仪器有限公司; JD－801 凝胶成像仪 江苏省捷达科技发展有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 二次沉淀收集 酱油二次沉淀制备方法采用静置和冷冻干燥法［2－3］，将酱油( 500m L，玻璃瓶装) 静置 10d，虹吸法抽去上清，留下最后约 20m L 酱油和沉淀，摇匀后在 4500r/min 的条件下离心 30min，获得酱油上清 S1 以及二次沉淀 P1，P1 经过冷冻干燥 3d后便获得粉状沉淀 P2( 收集量约为 0.75g /L) 。
1.2.2 酱油上清蛋白质收集 将收集过沉淀的酱油上清液 S1 与 20% 的三氯乙酸( TCA) 溶液 1∶1 混合，在冰浴条件下沉降 1h，混合物在 10000r/min 的条件下离心 10min，弃上清，获得上清蛋白质 S2。
1.2.3 凝胶电泳分析 将二次沉淀 P2 和上清蛋白质 S2 复溶于溶剂中( 含 8mol/L 尿素、1% SDS、1%β －巯基乙醇、0.05mmol /L Tris) ，在漩涡振荡器上混合均匀后，10000r/min 离心 5min，取上清用于电泳。
Tricine－ SDS－ PAGE 分析: 由于成品酱油中多肽多在 10ku 以下［10］，本研究采用了可以分析小于 10ku多肽的 Tricine－SDS－PAGE 凝胶系统，参照曹佐［11］ 改良的实验方法，浓缩胶浓度 5% ，分离胶浓度 16% ，阳极缓冲液 Tris 12.11g
定容至 500m L，6mol/L HCl调 p H 至 8.9，阴极缓冲液 Tris 6.06g、Tricine 8.96g、 SDS 0.5g 定容至 500m L，样品上样量均为 15μL，30V电泳半小时，100V 电泳至结束。凝胶在含有 50% 乙醇和 10% 冰醋酸的固定液中固定半小时后，在考马斯亮蓝 Ｒ－250 染色液中染色 3h，然后用含 10% 甲醇和 10% 冰醋酸的脱色液脱色至背景清晰，电泳图谱用 JD－801 凝胶成像仪记录，通过捷达 801 图像分析软件 3.3 分析。
1.2.4 MALDI－ TOF / TOF MS 鉴定 将凝胶上蛋白质条带使用自制切点器切下，装于 1.5m L 进口 EP 管中，经脱色、脱水后用胰蛋白酶进行酶解，酶解液经抽提浓缩后，在 Anchorchip 靶板上进行点靶，待样品完全干燥后，将靶板放入仪器 Ultraflextreme MALDI－TOF MS / MS( Bruker) 进行质谱数据的采集，使用肽段标准品( peptidecalibstandard II) 进行校正，数据结果使用 Bio Tools 软件整合。搜索参数为: 物种属为全物种; 数据库 NCBI; 切割酶为胰酶; 允许最大漏切位点为 1，Mascot 分值大于 55 即为鉴定成功。
1.2.5 氨基酸分析
1.2.5.1 游离氨基酸测定 酱油上清 S1 以及二次沉淀 P2 用 TCA( 浓度 5% ) 静置沉淀 1h 后用双层定性滤纸过滤，滤液经 10000r/min 离心 10min，取上清 液，利用高效液相色谱法测定游离氨基酸的含量。采用 HYPEＲSIL OSD 色 谱 柱 ( 250mm × 4.6mm，5μm) ，柱温 40℃ ，紫外检测器波长 338nm，洗脱流速1.0m L / min。
1.2.5.2 总氨基酸测定 酱油上清 S1 以及二次沉淀P2 经过 110℃ 水解 22h，水解液经过过滤蒸酸等步骤后用高效液相色谱法测定氨基酸组成。高效液相色谱测定条件同游离氨基酸测定条件。
1.2.5.3 氨基酸疏水性分析 根据 Lozano［12］的经验公式考察氨基酸的疏水性:HΦ × HΦavg= X
iqni×HΦi
Xi__表示各氨基酸摩尔百分含量，
HΦi__表示各氨基酸的疏水值。
1.2.6 数据分析 所有实验数据均测定 3 次，取其平均值。运用 SPSS 11.5 软件进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 电泳分析
图 1 为样品的 Tricine－SDS－PAGE 图谱，酱油上清 S2 主要有两条条带 c 和 d，条带 c 经软件计算分子量为 22.9ku，经积分光密度计算所占百分比为
1.65% ，d 处条带连成一片，分子量约从 2.0 ～ 14.0ku，可能是大豆蛋白质在酱油酿造过程中被蛋白酶切割成了分子量连续的多肽，所以电泳条带出现了连片 的情况。条带 d 经积分光密度计算，占比例为98.35% ，是 S2 中蛋白质的最重要组成部分。酱油沉淀 P2 主要有两条条带 a 和 b，经软件计算分子量分别约为 34.1ku 和 22.7ku，经积分光密度计算，两者分别占 P2 蛋白质的 19.80% 和 80.20% 。由以上分析可知，S2 中主要的蛋白质是分子量从 2.0～14.0ku 的多肽; 而 P2 中主要的蛋白质是一种分子量约为 22.7ku的蛋白质，在 S2 中同样发现了一种分子量约为22.9ku 的蛋白质，两者是否为同一种蛋白质需进行MALDI－ TOF / TOF MS 鉴定 。
注: 图中 M 为蛋白质标准品，1 为酱油上清 S2，2 为酱油沉淀 P2
2.2 MALDI－TOF / TOF MS 鉴定
为了鉴定沉淀中蛋白质的来源及上清蛋白质是否与酱油二次沉淀蛋白质同源( 条带 b 和条带 c) ，在图 1 中取点 a、b、c、d 进行 MALDI－ TOF/TOF MS 鉴定。条带 a 可信度最高的鉴定结果为大豆球蛋白( Glycinin) G1 亚基，Mascot 分值 155，条带 b 和 c 可信度最高鉴定的结果为大豆球蛋白( Glycinin) G4 亚 基，Mascot 分值分别为 254 和 76，条带 d 未鉴定成功。大豆蛋白质主要含有 7S
和 11S 两 个 亚 基，Glycinin 是指 11S 球蛋白( Globulin) ，Glycinin 中目前 主要鉴定出的亚基有 G1 ( A1aB1b) 、G2 ( A2B1a) 、G3( A1bB2) 、G4( A5A4B3) 和 G5( A3B4) ，每个亚基含有一个分子量大约在 32ku 左右的酸性端以及一个分子量在 20ku 左右的碱性端［13］。条带 a 的分子量与Glycinin 亚基酸性端相吻合，条带 b 和 c 分子量与Glycinin 亚基碱性端分子量相吻合。袁德保［14］曾测定了 Glycinin 各酸性端与碱性端的疏水性除了在其等电点下，大小依次为 A4＜ A3＜ A2＜ A1a＜ B。从分子量以及疏水性上可知，上述鉴定结果可靠，即条带a 为 Glycinin G1 亚基酸性端 A1a，条带 b 和 c 为Glycinin G4 亚基碱性端 B3，从而可知，酱油二次沉淀蛋白质的主要来源是 Glycinin 亚基碱性端 B3，并伴 有少量 Glycinin G1 亚基酸性端 A1a。d 点没有鉴定出结果，可能是因为这部分是大豆蛋白质被酶切割而成的短肽集合，无法找到匹配源。
酱油在经过巴氏消毒过滤等步骤出厂，澄清的酱油在货架上随时间逐步产生沉淀，沉淀并非一步形成的。由图 1 以及 MALDI－ TOF/TOF MS 鉴定结果分析可得，P2 中的蛋白质 b 是上清中的蛋白质 c逐步沉降而来，即上清中的蛋白质 c 是沉淀蛋白质的主要来源。P2 中蛋白质 a 应该也可以在 S2 中找到，可能因为其在 S2 中丰度太低而没有跑出可见条带。在图 1 中，虽然 S2 中的主要蛋白质都在条带 d中，占了 98.35% ，但在沉淀 P2 中几乎找不到明显的对应条带，这说明被蛋白酶切割得到的多肽溶解性较好，不易沉淀。
2.3 氨基酸分析结果
表 1 是酱油上清 S1 和二次沉淀 P2 的氨基酸组成测定结果，蛋白质氨基酸定义为总氨基酸减去游离氨基酸［15］( 总氨基酸与游离氨基酸未在表中列出) 。疏水值一栏数值越高疏水性越大。在酱油上清 S1 和二次沉淀 P2 中，氨基酸摩尔百分比最高的均为谷氨酸，其次是丝氨酸、天冬氨酸和甘氨酸，这与袁德宝［14］测定的大豆蛋白质中各氨基酸含量的趋势基本相符。但这几种氨基酸在 S1中所占比例分别比在 P2 中高 45.03% 、113.82% 、11.98% 和 25.81% ，它们的疏水值均等于小于 0.00，是 4 种亲水性氨基酸。而疏水值大于等于 1.00 的氨基酸在 P2 中的比例则普遍高于 S1，说明二次沉淀蛋白质中疏水性氨基酸比例高。 值得注意的是，疏水值较高的脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸在 S1中几乎检测不到，而在 P2 中却占有一定的比重。根据 Lozano［12］经验公式计算
和 11S 两 个 亚 基，Glycinin 是指 11S 球蛋白( Globulin) ，Glycinin 中目前 主要鉴定出的亚基有 G1 ( A1aB1b) 、G2 ( A2B1a) 、G3( A1bB2) 、G4( A5A4B3) 和 G5( A3B4) ，每个亚基含有一个分子量大约在 32ku 左右的酸性端以及一个分子量在 20ku 左右的碱性端［13］。条带 a 的分子量与Glycinin 亚基酸性端相吻合，条带 b 和 c 分子量与Glycinin 亚基碱性端分子量相吻合。袁德保［14］曾测定了 Glycinin 各酸性端与碱性端的疏水性除了在其等电点下，大小依次为 A4＜ A3＜ A2＜ A1a＜ B。从分子量以及疏水性上可知，上述鉴定结果可靠，即条带a 为 Glycinin G1 亚基酸性端 A1a，条带 b 和 c 为Glycinin G4 亚基碱性端 B3，从而可知，酱油二次沉淀蛋白质的主要来源是 Glycinin 亚基碱性端 B3，并伴 有少量 Glycinin G1 亚基酸性端 A1a。d 点没有鉴定出结果，可能是因为这部分是大豆蛋白质被酶切割而成的短肽集合，无法找到匹配源。
酱油在经过巴氏消毒过滤等步骤出厂，澄清的酱油在货架上随时间逐步产生沉淀，沉淀并非一步形成的。由图 1 以及 MALDI－ TOF/TOF MS 鉴定结果分析可得，P2 中的蛋白质 b 是上清中的蛋白质 c逐步沉降而来，即上清中的蛋白质 c 是沉淀蛋白质的主要来源。P2 中蛋白质 a 应该也可以在 S2 中找到，可能因为其在 S2 中丰度太低而没有跑出可见条带。在图 1 中，虽然 S2 中的主要蛋白质都在条带 d中，占了 98.35% ，但在沉淀 P2 中几乎找不到明显的对应条带，这说明被蛋白酶切割得到的多肽溶解性较好，不易沉淀。
2.3 氨基酸分析结果
表 1 是酱油上清 S1 和二次沉淀 P2 的氨基酸组成测定结果，蛋白质氨基酸定义为总氨基酸减去游离氨基酸［15］( 总氨基酸与游离氨基酸未在表中列出) 。疏水值一栏数值越高疏水性越大。在酱油上清 S1 和二次沉淀 P2 中，氨基酸摩尔百分比最高的均为谷氨酸，其次是丝氨酸、天冬氨酸和甘氨酸，这与袁德宝［14］测定的大豆蛋白质中各氨基酸含量的趋势基本相符。但这几种氨基酸在 S1中所占比例分别比在 P2 中高 45.03% 、113.82% 、11.98% 和 25.81% ，它们的疏水值均等于小于 0.00，是 4 种亲水性氨基酸。而疏水值大于等于 1.00 的氨基酸在 P2 中的比例则普遍高于 S1，说明二次沉淀蛋白质中疏水性氨基酸比例高。 值得注意的是，疏水值较高的脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸在 S1中几乎检测不到，而在 P2 中却占有一定的比重。根据 Lozano［12］经验公式计算
的 P2 的平均疏水值为0.71，而S2 的平均疏水值仅 0.33，前者比后者高115.15% ，方差分析显示两类蛋白质的平均疏水值存在显著性差异( p ＜ 0.05) 。上述分析结果与 P2 中的蛋白质是来源于酱油二次沉淀( 不溶性蛋白质) ，S1中的蛋白质是来源于酱油上清液( 水溶性蛋白质) 的现象相吻合。同时也说明大豆蛋白质( 或多肽) 中部分蛋白质( 或多肽) 的高疏水性是导致其形成酱油二次沉淀的重要原因。
3 结论
通过以上分析，主要得出以下结论:
3.1 酱油二次沉淀中的蛋白质分别是来源于大豆球蛋白质 G4 亚基碱性端 B3和 G1 亚基酸性端 A1a，两者分别占酱油二次沉淀蛋白质的 80.20% 和 19.80% 。 碱性端 B3和酸性段 A1a是 11S 大豆球蛋白的重要组成部分，而 11S 大豆球蛋白是大豆中最重要的蛋白质来源。
3.2 酱油二次沉淀蛋白质氨基酸组成与酱油上清蛋白质相比存在明显差异，其蛋白质平均疏水值显著高于后者，这是酱油二次沉淀蛋白质氨基酸组成的主要特征，也是酱油二次沉淀蛋白质形成的重要原因。
因此，如果通过某种方式去除或者降解酱油中Glycinin G4 亚基碱性端 B3和 G1 亚基酸性端 A1a，可有效解决酱油二次沉淀问题，这需要进一步的研究 来证实。
参考文献
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