有限稀释法

有限稀释法

有限稀释法是一种常用的克隆方法。

将需要再克隆的细胞株自培养孔内吸出并作细胞计数，计出1mL的细胞数。 用HT培养液稀释， 使细胞浓度为50～60个/mL，于96孔培养板中每孔加0.1mL(五六个细胞/孔)。接种2排，剩余细胞悬液用HT培养液作倍比稀释，再接种2排，如此类推，直至使每孔含0.5～1个细胞。培养7～10d后，选择单个克隆生长的阳性孔再一次进行克隆。一般需要如此重复3～5次，直至达100％阳性孔率时即可，以确保抗体由单个克隆所产生。

实验五 细胞克隆化培养技术—有限稀释法

一、实验目的：

1、掌握用有限稀释法进行细胞克隆化培养技术；

2、学会细胞克隆形成的辩观察技能；

3、配合抗体分泌细胞筛选技术，确定抗体分泌细胞。

二、实验原理：

克隆化培养即单细胞培养技术，用有限稀释法进行杂交瘤细胞克隆化培养，可以及时确定阳性杂交瘤细胞株，同时淘汰因发生染色体丢失或抗体的轻、重链基因分离而出现无抗体分泌阴性细胞株。

一般杂交瘤细胞需经过52—3次反复克隆后，才能达到100%细胞阳性率。

该办法亦适用于一般细胞培养中的细胞纯化、突变细胞株的选择，识别和分离。是细胞株的常用方法。

三、实验材料：

杂交瘤细胞、25毫升培养瓶、96孔细胞培养板（天津有机玻璃厂）、移液管（1毫升、5毫升、10毫升）、弯头滴管、倒置显微镜、CO2培养箱、白细胞计数板、计数器、盖玻片、防水笔、RPMI-1640、小牛血清、青链霉素、10毫升刻度离心管，00橡胶塞，饲养细胞（3-6×105/ml、见腹腔细胞的制备）。

四、实验步骤：

1、分装了每孔0.1毫升腹腔细胞的96孔细胞培养板（可提前24小时准备就绪，置CO2培养箱中备用）；

2、自细胞培养瓶中收集长势良好的杂交瘤细胞（亦可自24孔培养板孔中收集），制成悬液。

3、按白细胞计数方法准确计得细胞悬液的细胞数，一般在105/毫升左右。

4、取3支10毫升刻度离心管排列在超净工作台试管架上，先用无血清培养基将细胞稀释至103/毫升，再用含15%小牛血清的完全培养基稀释到101/毫升细胞，即每0.1毫升1个细胞。

5、每孔0.1毫升细胞悬液。

6、置37℃5%CO2培养箱，4天后取出观察，并在板盖上打上标记，做好记录并统计结果。

7、继续培养时，则在第4-5天更换1/2培养基，约第7-9天可以收获培养液上清用于检测抗体。并重复检测1-2次。

8、选择单克隆生长孔，生长良好，阳性强者，转移到24孔板再做克隆经培养或扩大培养。

五、实验结果：

实验结果以总细胞孔（如96孔）中出现克隆孔统计出克隆百分率，并可进一步按单细胞孔、双细胞孔、多细胞孔分别计算出百分率。

六、注意事项：

1、注意无菌操作，一旦发现污染（孔）必须及时处理；

2、计数细胞要求准确，稀释量亦要准确，否则将造成一孔多细胞克隆或克隆百分离太低；

3、在计数克隆出现率之前，不宜更换培养液，也不宜强烈振动培养板；

4、做克隆化培养的小牛血清必须是优质血清；

5、若做克隆抗体检测时，特别要保护细胞的生长状况，防止细胞生长不良甚至丢失。

七、说明：

哺乳动物细胞通过分离、稀释接种，培养在适宜于单细胞生长的培养液中，形成细胞克隆。运用这项技术可以制作细胞成活曲线，即在接种相同数量细胞的培养瓶中，加入不同浓度的化学药品，或照以不同剂量的射线，观察其对细胞的听见害程度。由此可以在哺乳类细胞中进行诱变试验及分离突变细胞

ELISPOT与ELISA 、有限稀释法、四聚体法、Cr51释放

法、胞内CK染色法比较

ELISPOT的历史可以追溯到1963年Jerne等人创立的溶血空斑技术（hemo-lytic plaque forming cell assay ，HPF），这项技术可用于检测并计数单个抗体形成细胞。随着单克隆抗体技术的成熟，1983年，Czerkinsky等采用此法检测脾细胞中分泌特异性抗体的细胞数，发现该方法敏感性高简便易行。后来，他们又用这种方法定量分析受到有丝分裂原刺激的外周血中分泌IFN2γ的细胞数。随后，用ELISPOT法在单细胞水平检测分泌其他细胞因子（如IL-2 ， IL-4 ， IL-5 ， IL-10 ， TNFα和IL-6） 数量的手段也被建立起来。Nordstrom 等用生物素-抗生物素蛋白生物放大法来提高这种方法的敏感性，Herr用计算机辅助图像分析系统（computer-assisted video image analysis ，CVIA） 自动分析TNF2α酶联免疫斑点的大小和数量，计算与负载抗原肽的靶细胞接触后外周血单核细胞（PBMC） 中抗原特异性CD8+T细胞的数量，不但提高了对背景染色的分辨力也使大规模研究成为可能。Vaquerano等将数码相机和计算机结合起来，开发出类似的斑点计数系统，认为当每孔斑点数大于100时，这种方法更客观、可重复性高且节省时间。

随着ELISPOT技术的不断发展，它的优势也渐渐显示出来，下面将列举ELISPOT对比其它一些传统技术的优势所在。

一、ELISA

ELISA 通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。ELISPOT 也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过计算机辅助的分析系统对斑点进行计数， 1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率） 由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。捕获抗体具有高亲和力、高特异性、低内毒素的单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。

二、有限稀释法（limiting dilution analysis ，LDA）

LDA能够对特异性CTL细胞进行定量，曾在很多年中被认为是CTL 检测的“金标准”，它使人们能够详细了解免疫反应动力学和记忆毒性T淋巴细胞（memorial CTL， mCTL） 亚群的细胞周期。但该方法需要高强度抗原刺激， 这会加快效应CTL（eCTL）凋亡，且不能定量测定eCTL细胞数量或测定值偏低。其次，该方法较繁琐，培养时间可长达2～3周，而且很容易造成T细胞数量损失。

三、四聚体法（Tetramer）

最近几年出现了MHC2Ⅰ类分子抗原肽四聚体法。该法的优势在于迅速、直接、灵敏且特异性强，即使当体内mCTL水平低于1%，用MHC2Ⅰ抗原肽四聚体法仍可直接测到准确的值，比LDA 敏感度要高5～10倍。但该技术也存在较多应用上的困难：除了合成及稳定MHCⅠ类分子的技术困难外，最主要缺点是表位的选择。由于每次反应只能分析单一的抗原表位，而MHCⅠ类分子结合的各种表位，能否形成CTL反应，却随着基因背景及时间的变化而变化，因此选择正确的表位就显得尤为重要。优势表位的筛选可以通过Elispot 来进行，但对整个肽库进行扫描，并不是一件很容易的事。当然，生物信息学的运用对表位的筛选有很大的帮助。同时，有研究结果表明，并非所有经过Tetramer 鉴定的阳性细胞都有确切的功能， Tetramer阳性的细胞数是用ELISPOT分析能分泌INF2γ细胞数的10倍，其中很多是不表现功能的惰性细胞，可能代表了记忆型CTL前体细胞。Tetramer分析只增加了分析的灵敏度，同时测定其功能很重要。

四、Cr51释放法

此法是一种比较经典的方法，虽然在检测CTL识别的抗原多样性方面非常有效，且能精确阐明被CTL识别的最佳表位，但至多为半定量的层面，而且Cr51标记细胞的自发释放率较高，不适于较长时间培养；标记时所需的细胞浓度较高，因而给试验带来诸多不便；此外，Cr51释放法所测定的是一个细胞群体的特性，而不是单个细胞。

五、胞内CK染色法

与ELISPOT法相比较，胞内CK染色法（intra-cellular CK staining，ICS） 主要应用细胞内累积细胞因子的染色和多色参数的FACS法，是检测循环淋巴细胞中抗原特异性T 淋巴细胞的可行方法，而ELISPOT法却可以检测所有分泌CK的eCTL。