Caspase 3 活性检测试剂盒(比色法)
Caspase 3活性检测试剂盒(比色法)
简介:
Caspase 3又称CPP32、Yama 、apopain 、Caspase-3,属于CED-3亚家族,是细胞凋亡过程中的一个关键酶。Caspase 3活性检测试剂盒(比色法) (Caspase 3 Colorimetric Assay Kit) 的检测原理是利用Caspase 3催化底物p -nitroanilide (Ac-DEVD-p NA) 产生黄色的游离硝基苯胺p NA(p -nitroaniline) ,通过分光光度比色法测定p NA 在400~410nm 处吸光值,从而间接获得caspase 3的活性。
操作步骤(仅供参考) :
1、 制备标准曲线:
①_x0001_
按照Caspase Lysis buffer:Assay buffer=1:9的比例配制适量的标准用标准品稀释液稀释p NA(10mM),另外设置一管不加p NA 仅含标准品取p NA 浓度分别为200μM 、100μM 、50μM 、25μM 、12.5μM 、6.25
品稀释液。 ②_x0001_ ③_x0001_
稀释液作为零管,把以上系列浓度物质作为标准品。
μM 、0的标准品各100 μl 加入至96孔板或取适量体积加入至容量不超过100μl 的比色杯,测定405nm 处吸光值即A 405。 ④_x0001_
用每一个标准品的A 405减去不含p NA 的空白对照的A 405,计算出实际
的吸光值。以每个浓度的标准品A 405为x 轴,以对应的p NA 浓度为y 轴,用Excel 制作p NA 浓度对A 405值的标准曲线。
2、 样品裂解:
①_x0001_
悬浮细胞:取实验样品和对照样品,离心收集细胞,小心吸除上清,同
时确保尽量没有细胞被吸除,PBS 洗涤一次,再次小心吸除上清。按每2~10×106细胞加入Caspase Lysis buffer的比例加入Caspase Lysis buffer,重悬细胞沉淀冰浴裂解。 ②_x0001_
贴壁细胞:弃细胞培养液,用胰蛋白酶消化贴壁细胞,收集至细胞培养
液,离心,小心吸除上清,同时确保尽量没有细胞被吸除,PBS 洗涤一次,再次小心吸除上清。按照每2~10×106细胞加入Caspase Lysis buffer 的比例加入Caspase Lysis buffer,重悬细胞沉淀冰浴裂解。 ③_x0001_
解。 ④_x0001_ ⑤_x0001_
离心取上清至新的1.5ml 离心管。立即测定Caspase 3的酶活性或-70℃蛋白定量:由于Caspase Lysis buffer含还原剂不宜采用BCA 法,可采
保存样品。
组织样品:按每3~10mg 组织加入Caspase Lysis buffer 的比例加入
Caspase Lysis buffer ,冰浴上用玻璃匀浆器匀浆并转移至1.5ml 离心管中冰浴裂
用Bradford 法测定蛋白浓度。以蛋白浓度达到1~3mg/ml为佳,否则应增加细胞或组织的量。
3、 样品检测:
① 按照下表设置96孔板反应体系,溶液应按照顺序依次加入,即Assay buffer→待
测样品→Ac-DEVD-p NA(2mM),大多数情况下,每个反应体系加入10~15μl 待
② 孵育:盖紧96孔板孵育。肉眼可见颜色发生变化时,即可进行A 405检测;如果颜
色变化不明显,可适当延长孵育时间甚至过夜。
③ 待测样品A 405分别减去空白对照A 405即为样品Caspase 3水解底物产生的p NA
吸光值,根据标准曲线即可获得酶的含量。
④ 用Bradford 法检测待测样品中的蛋白浓度(由于裂解液中含有较高浓度的DTT ,不
适合采用BCA 法进行蛋白浓度测定) ,进而计算出一个样品单位重量蛋白中所含的caspase 3的酶活力单位即Caspase 3酶活力单位/mg protein。
计算结果:
① Caspase 3酶活力单位的定义:即当底物饱和时,在37℃一个小时内可以剪切
1nmol Ac-DEVD-p NA 产生1nmol p NA 的caspase 3的酶量。根据p NA 标准曲线和样品A 405值,可计算出Caspase 3酶活力单位。
② Caspase 3酶活性的另外一种表示方法是Caspase 活性增加的百分比即实验处理
组A 405/实验对照组A 405×100%,简单而可靠,可粗略的反应酶活性情况。
注意事项:
1、 建议每次测定时都做标准曲线,以使标准更准确,另外标准品需避免反复冻融。 2、 如果没有酶标仪,也可以使用普通的分光光度计测定,但应考虑根据比色杯的最小检
测体积,尽量采用100μl 体积以内的比色杯。
3、 所测样本的值高于标准曲线的上限,应用裂解液稀释样品后重新测定。
4、 样品蛋白有效含量过低或Caspase 激活水平过低都会导致实际测得的A 405过低,应注
意使蛋白浓度尽量达到1~3μg/ml,调整诱导凋亡的时间和条件。
5、 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。