Rab4蛋白参与DC细胞内源性抗原递呈

　　摘要：目的 通过实验研究，观察Rab4在DC细胞中产生的影响，对卵白蛋白的细胞株稳定表达，并研究这些影响对其内源性产生的递呈抗原。方法 在研究初期，要构件一个内部含有OVA蛋白基因的质粒，这种质粒的英文名称为pLentimycVOA，属慢病毒。接下来，要使用沉淀法来制备慢病毒，这里使用的是DNA-磷酸钙试剂，通过沉淀转染293FT细胞。接着要用病毒去感染DC-VOA，并及时用流行细胞术的方式对其感染率进行检测；检测结果出来后，应使用显微镜（这里使用的是激光共聚焦型）观察Rab4突变体的定位与表达，最后再用T细胞杂交瘤（一种能够识别肽复合物的物质）来对B3Z进行检测，之后就可以进行抗原递呈的观察了。结果 DC-OVA细胞在慢病毒的影响下会被高效感染，经过感染的Rab4会产生一定程度的突变，在DC-OVA中，这些突变能够被稳定表达出来，主要在细胞膜四周的囊泡结构中不均匀的分布，因此，Rab4蛋白参与到DC细胞中，会对其内源性抗原递呈产生正相关性的影响。结论 通过观察，能够清楚地观测到Rab4的突变体在DC细胞中的分布情况，证实Rab4蛋白通过对其活性状态的改变能够对DC细胞的内源性抗原产生影响，并且这种影响呈现正相关的递呈状态。 　　关键词：Rab4蛋白；DC细胞；抗原递呈 　　蛋白酶经过消化后，会变为多肽，与内质网里面的MHG-1类型的分子发生反应，形成一种复合物，并转运到细胞膜中。生物体的免疫系统能够自动对细胞膜中存在的非自身分子进行识别，这里就是识别MHC-1类分子，对异常细胞进行清除，异常细胞主要是指病毒或是蛋白变异的细胞，会对细胞内环境的稳定造成影响。对于DC细胞而言，就我国目前研究阶段来看，只指知道它是体内功能最强的专门用来进行抗原递呈的细胞。这种细胞在进行抗原递呈过程中，在递呈MHC多肽复何物的同时会细胞内表面进行高度刺激，让细胞表面分泌出大量的细胞因子，让初始CD8+T的细胞被活化，生成效应性的T细胞（CTL），将异常细胞消灭掉。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　就目前研究成果来看，DC细胞又被称为树突状细胞，能够有效启动机体的免疫应答。传统研究显示，通过内源性抗原实验，这种细胞能够有效让CD8+T细胞活化，达到抗病毒免疫的效果，还能够提高机体本省对外周及中枢的耐受能力。DC的内源性抗原递呈是一个连续性较强的细胞膜的运转过程，与蛋白酶的影响密不可分。 　　为了进一步的了解Rab4蛋白对DC细胞产生的影响，明确其在内源性抗原中的作用，实验构建了Rab4蛋白在显性与显性负突变体在慢性病毒变异上的表达载体，在显微镜的观察下发现Rab4的细胞结构与其表达定位，并运用流式细胞术来对感染效率进行检测。为了进一步了解Rab4蛋白参与到DC细胞抗原递呈的机制，对抗原环节进行有效控制，研究者们做了如下实验。 　　1.2 一般方法 　　1.2.1 主要试剂 　　实验用到的实际主要选用鼠1L-2酶联来进行免疫吸附的实验，其试剂盒是BD公司生产的，试剂由1640以及DMEM培养完成。 　　1.2.2 菌种、质粒以及细胞 　　质粒的载体由实验室进行保存于构建。对于包膜蛋白的治理以及慢病毒的包装质粒，其保存要科学合理，实验中使用的这些质粒是由本研究所的遗传因子研究时提供的，实验中用道德细胞株也是受奇特研究所惠赠。 　　1.2.3 构建慢病毒表达载体 　　两种不同的质粒在进行分别的双酶切之后，10g/L的琼脂糖凝胶电泳要进行回收，并将其纯化，接着将载体跟目的基因进行反应链接工作，这种连接一般是在4摄氏度的温度下进项长达12小时的反映。 　　1.2.4 制备慢病毒 　　慢病毒的制备需要用到DNA磷酸钙共沉淀的方法来完成。在转染的前一天晚上，要将细胞按照2*106的比例接种在100mm的同其中，这里实验容器选择平皿，接着加入10ml的完全DMEM培养基进行培养。 　　第二天，要将25mmol/L的氯喹加入到培养皿中，将其静置一小时，然偶加入少量包膜担保质粒、包装质粒以及转移质粒，在搅拌均匀后，快速的加入2*HBS，通过剧烈的震荡进行搅匀，再滴入培养皿中。这里要尤其注意滴入方法，不能直接倒入，而是应该一滴一滴的滴入。 　　接下来，要将培养皿在37摄氏度的环境中孵育8小时，然后换入10ml新的培养液，两天之后采集病毒的上清，在经过过滤之后使用。 　　1.2.5 OVA蛋白的稳定表达与构建DC2.4细胞株 　　在感染前一天，将DC2.4细胞（生长旺盛的）以5*104的比例接种道4孔板中，在进行感染的过程中要加入1ml的病毒上清液，在一天之后更换培养液，在培养一天。在实验结束后，要进行筛选工作，对照未感染的细胞来分析其抗性克隆的形成。再挑选其中的阳性克隆继续进行传代培养，并将其命名为DG0OVA细胞。 　　1.2.6 FACS分析 　　将DC-OVA细胞进行搜集，取每管10ml，在里面加入鼠1Gg1k同型对照抗体0.1mg或是纯化的杂交瘤细胞25D1.16上清液0.1mg，在4摄氏度的环境下防止半小时后，PBS洗细胞两次，在以1/100的比例加入FITC 标记羊抗鼠IgG 荧光二抗悬浮细胞，然后在避光、室内的环境下放置半小时，再用PBS洗2次，检测表面荧光。在对细胞表秒进行荧光检测时，需要使用流式细胞仪来检测。 　　1.2.7 抗原递呈实验 　　基于B3Z细胞可特异识别细胞递呈的OVA抗原表位，实验过程中要将一部分细胞使用不完全的RPMI1640培养液进行悬浮，然后将其放在20mg/孔的容器中，在37摄氏度的条件下培养3小时，再用10g/L多聚甲醛固定20分钟，才能进行最终试验结果的观察。 　　2 结果 　　通过使用慢性病毒的转染方法，在DC-OVA细胞中表达Rab4蛋白对DC细胞内源性抗原的递呈研究，检验其抗原递呈能力，发现与转染空载体对比而言，Rab4能够有效抑制DC的内源性抗原递呈，其表现出P　　Rab蛋白的抑制作用分析，对蛋白调节内源性抗原递呈的临床影响。在研究后可知，Rab5A、Rab11以及Rab7蛋白的变化没有影响到内源性抗原递呈，而Rab4蛋白却对内源性抗原递呈产生了明显的抑制。而MHC I-肽复合物通过胞膜的转运后，不仅与Rab4蛋白对其调控有直接联系，还与内吞体通过一定的途径回运至胞膜有联系[1]。 　　3 结论 　　传统研究多是对体细胞的抗原递呈，对于DC细胞的研究较少，DC细胞织机上是一种树状细胞，在研究上需要构建模型来进行内源性抗原递呈的研究。内源蛋白会形成降解，而在其降解之后，MHC-I分子和ER分子会相互融合进而产生新的复合物，该复合物还能够与内吞体相互融合并作用，以ER为载体返回到细胞表层，然而Golgi体的糖基化效果由此消失，那么相关功能就无法发挥，也无法通过多条转运的方式对内源抗原递呈进行调节和补偿[2]。 　　通过建立有效的DC内源抗原递呈实验模型，将Rab蛋白与上述抗原递呈相互作用而表现出的相应联系进行细致研究，该研究能够有效探明内源递呈的性质以及对肿瘤、病毒等疾病产生临床效果和治疗作用等要素，为相关疾病的治疗做出了贡献[3]。 　　参考文献： 　　[1]柴琳琳，万瑛，吴玉章，邹丽云. Rab4蛋白的细胞内定位及其活性改变对DC内源抗原递呈的影响[J].免疫学杂质，2012（10）：239-247. 　　[2] 阴晴，邵启祥，王金湖.DC的分化和Th1、Th2细胞的诱导[J].江苏大学学报（医学版），2003，3（01）：231-232. 　　[3] 罗建飞，陈必成，陈忠华.小鼠骨髓来源树突状细胞和DC2.4形态与功能比较[J].中国康复，2005，3（03）：120-121.