黄芩总黄酮的提取及羟基自由基清除方法比较

JTCVM

2010年第5期

黄芩总黄酮的提取及羟基自由基清除方法比较

冯雷，吴冬青，王永生，安红钢，王军霞，任雪峰

（河西学院化学系，甘肃张掖

摘

734000）

要：以60%乙醇为提取溶剂，采用回流提取技术提取黄芩中的黄酮，利用芦丁作为对照，用分光光度法测定

黄芩中黄酮的含量。通过不同方法考查黄芩中黄酮类化合物清除羟基自由基的能力，结果表明，黄芩中黄酮对羟基自由基具有不同的清除能力，用7.5mmol/L的硫酸亚铁铵溶液0.80mL，7.5mmol/L的水杨酸-乙醇1.00mL，0.3%的H2O2溶液1.00mL，Tris-HCl缓冲液2.00mL清除效果最佳。

关键词：黄芩；黄酮；超声波辅助提取；羟基自由基中图分类号：S853.74

文献标识码：A

文章编号：1000-6354（2010）05-0007-04

《神农芩属植物黄芩的干燥根，系多年生草本植物[1]。史载于本草经》，列为中品，其性寒味苦，具有清热燥湿、泻火解毒、

基金项目：甘肃省教育厅（0509-02）科研资助项目作者简介：冯

雷（1972-），男，实验师，主要从事有机合成及分析研究。通讯作者：任雪峰

黄芩（ScutellariabaicalensisGeorgi）为唇形科（Labiatae）黄

止血安胎的作用[2]。黄芩在临床应用上已有两千多年的历史。除中医配方外，大量用作中成药的原材料。目前黄芩及其提取物的需求量逐年增大，已成为大宗药材之一。黄芩主要分

发油等化学成分。

3.2

体外抗菌效果

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

抗菌有效成分基本都有，因此，其抗菌作用可能是多种化学成分综合作用的结果，其药效与药理作用机制还有待进一步深入研究。白花草具有来源广、价格便宜、对多种病原菌均有较强的抗菌作用等优点，可用于兽医临床治疗相关病原菌引起的疾病，具有一定的开发应用前景。

参考文献：

白花草乙醇提取物体外抑菌试验结果表明，其对大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等常见病原菌具有明显的抑制作用，高敏菌有金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌和沙门氏菌，其抑菌圈直径分别为（17.82±2.42）mm、（16.80±1.55）mm和（16.00±3.46）mm；中敏菌有大肠杆菌和链球菌，其抑菌圈直径分别为（13.40±2.15）mm和（14.30±1.82）mm。白花草乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的MIC为0.063g/mL；对巴氏杆菌和沙门对链球菌为0.25g/mL；大肠杆菌为氏杆菌为0.125g/mL；

0.5g/mL。可见白花草乙醇提取物对金色葡萄球菌的抑菌作用最明显。

3.3

小结

调

查研究

［1］周萍主.中国民间百草良方［M］.长沙：湖南科学技术出版

社，2002.

［2］冯洪钱.民间兽医草本［M］.北京：科学技术文献出版社，1993.［3］张秀琴.中药化学［M］.北京：中国医药科技出版社，2003.［4］林启寿.中草药化学成分分析［M］.北京：科学出版社1997：

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社，1992.

［6］任仁安.中药鉴定学［M］.上海：上海科技出版社，1986：466.［7］陈

奇.中药药理学实验［M］.上海：上海科学技术出版社，1988.

白花草乙醇提取物对5种病原菌有明显的抑制作用。现已知具有抗炎作用的中草药成分有生物碱、有机酸、黄酮及其甙类、皂甙和挥发油等化学成分[4]。白花草中这些

StudyonthechemicalcompositionsandantibacterialeffectsofHabenariadentata（Sw.）Schltr.

YOUSi-xiang，TANPin-xin

（CollegeofAnimalScienceandTechnology，HunanAgriculturalUniversity，ChangshaHunan410128，China）

Abstract:Thepre-testtubemethodandcircularfilterpapermethodwereusedtoisolateandidentifythechemicalcomposition

inHabenariadentata（Sw.）Schltr.．TheresultsshowedthatHabenariadentata（Sw.）Schltr.containedphenolicsubstances，organicacid，alkaloids，sugar，tannicacid，phytosterin，triterpenoid，flavonoidandtheirglycosides，saponin，volatileoilsandsoon．TheantibacterialactionofethanolextractfromHabenariadentata（Sw.）Schltr.againstcommonmicroorganismweredeterminedbydoubledilutionmethodandpaperdiskmethod.TheresultsindicatedthatethanolextractfromHabenariadentata(Sw.)Schltr.showedstrongantibacterialactiontoyellowStaphylococcus，Pasteuriapenetrans，Escherichiacoli，StreptococcusandSalmonella.Thediameterofinhibitionzonetoabovepathogenicbacteriawasrespectively17.82±2.42mm，16.80±1.55mm，13.40±2.15mm，14.3±1.82mmand16.±3.46mm；thecorrespondingminimuminhibitoryconcentration（MIC）was0.063g/mL，0.125g/mL，0.5g/mL，0.25g/mLand0.125g/mL.

Keywords:Habenariadentata（Sw.）Schltr.；chemicalcompositions；antibacterialaction

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布于我国黑龙江、吉林、辽宁、河北、河南、山东、山西、内蒙古、甘肃、陕西、宁夏等省、自治区。黄酮类化合物是一类在自抗氧化、抗突然界广泛分布的多酚类物质，具有清除自由基、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和调节免疫等功能，目前国内外学变、

者已从许多植物中提取出具有生物活性的黄酮类化合物[3]。黄酮类化合物常用的提取方法有溶剂提取法、微波提取法、超声波提取法、酶解法、超临界流体萃取法等[4]。超声波提取法是利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，促使植物材料中的有效成分进入溶剂，从而增加有效成分的提取率，缩短提取时间，并且还可以避免高温对提取成分的影响。因此，采用超声波辅助提取法提取黄芩中的黄酮。

羟基自由基（HO·）是已知最强的氧化剂，它反应性极强，寿命极短，几乎可以与所有细胞成分发生反应，对机体危害极大[5]。而且它有强的与木素碳水化合物反应的能力，在很多过氧化氢漂白的过程中，由于存在重金属离子或高温的影还响使体系中产生羟基自由基，对漂白结果产生重要影响[6]，

9]

。以芦丁含量为空白试剂为参比，在510nm处测定吸光度[8，

横坐标，吸光度值为纵坐标作回归曲线。1.4.21.4.2.1

黄酮提取工艺流程及含量测定黄酮提取工艺流程

准确称取黄芩粉末1.0000g，

提取时间3.5h、料液比为1∶50、提取温在乙醇浓度为60%、

度60℃条件下进行回流提取，趁热过滤，将滤渣继续回流，重复3次，将3次滤液合并，浓缩至浸膏状，用60%乙醇定容于100mL的容量瓶中（平行5份）。1.4.2.2

样品中黄酮含量的测定

准确吸取1.00mL的样品

备用液，参照1.4.1.2，测定样品在510nm处的吸光度值，由下式计算样品中总黄酮含量：

Y为总黄酮含量，mg/g；x为芦丁含量，mg；d为稀释式中：

倍数；w为黄芩粉末质量，g。1.4.31.4.3.1

黄酮类化合物清除羟基自由基测定

邻二氮菲-磷酸缓冲液法[10]此方法中由邻二氮菲和

可以发生去氢、加成、电子转移等反应，能与氨基酸、蛋白质、核酸和脂肪等生命物质发生氧化反应，造成生物机体损伤，导致衰老和疾病。笔者等采用超声波辅助提取法提取黄芩中通过不同的方的黄酮，并采用分光光度法[7]检测羟基自由基，法测定黄芩中黄酮提取液对羟基自由基的清除能力。11.1

材料与方法材料

硫酸亚铁产生有色物质，加入过氧化氢产生羟基自由基，可利用其产生的有色物质的吸光度值来检测羟基自由基，加入黄酮样品液会使得其中的有色物质减少，而此时溶液的吸光度值也会随之减小，因此可以计算黄酮样品提取液对羟基自①空白参比（A0）：准确吸取磷酸缓冲液（PBS，由基的清除率。

pH值为7.4）1.80mL，蒸馏水8.20mL，定容于10.00mL容量瓶②未损伤（A1）：加5×10-3mol/L中，摇匀作为空白参比调零；邻二氮菲0.60mL（下同），PBS1.80mL，7.5×10-3mol/L（下同），用蒸馏水定容至10.00mL，摇匀；③FeSO4溶液1.20mL

损伤（A2）：加邻二氮菲0.60mL，PBS1.80mL，FeSO4溶液1.20mL，1%H2O2溶液1.00mL，用蒸馏水定容至10.00mL，摇匀；④样品参比（Axo）：PBS1.80mL，黄酮样品提取液1.00mL，用蒸馏水摇匀；⑤加药（Ax）：加邻二氮菲0.60mL，定容至10.00mL，

PBS1.80mL，FeSO4溶液1.20mL，黄酮样品提取液1.00mL，1%H2O2溶液1.00mL，用蒸馏水定容至10.00mL，摇匀。将上37℃保温反应1h，然后述各试液同时置于恒温水浴锅中，

在536nm波长处测定各吸光度值，以0.5000mg/mL芦丁溶液为对照样品，并用下式计算黄酮对羟基自由基的清除率：

-(A2-A0)×100%羟基自由基清除率=（Ax-Axo）

121.4.3.2

邻二氮菲-蒸馏水法

此方法与1.5.1方法中不同

的是用蒸馏水代替磷酸缓冲液，由邻二氮菲和硫酸亚铁显色，加入过氧化氢产生羟基自由基，利用其产生的有色物质的吸光度值来检测羟基自由基，并计算黄酮样品提取液对羟基自由基清除率。①空白参比（A0）：用蒸馏水作为空白参比；②未损伤（A1）：5×10-3mol/L的邻二氮菲（下同）加0.60mL，7.5×10-3mol/LFeSO4溶液0.80mL（下同），用蒸馏水定容至10.00mL容量瓶中，摇匀；③损伤（A2）：加邻二氮菲0.60mL，FeSO4溶液0.80mL，2%H2O21.20mL，用蒸馏水定容至10.00mL，摇匀；④样品参比（Axo）：取1.00mL的黄酮样品提取液，用蒸馏水定容至10.00mL，摇匀；⑤加药（Ax）：加邻二氮菲0.60mL，FeSO4溶液0.80mL，黄酮样品提取液1.00mL，2%H2O21.20mL，摇匀。将上述各试液同时置于37

℃用蒸馏水定容至10.00mL，

调

查研究

黄芩：产自甘肃陇西。将黄芩用蒸馏水洗净后切片，置于研碎后过60目筛备用。烘箱（40℃）烘干至恒重，1.2

试剂

70%乙醇，芦丁（中国药品生物制品检定所），硝酸铝，氢氧化钠，亚硝酸钠，磷酸缓冲液（PBS，pH值7.4），邻二氮菲，过氧化氢，罗丹明B，浓硫酸，硫酸硫酸亚铁，水杨酸-乙醇，亚铁铵，水杨酸-乙醇，Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液0.1mol/L）等试剂均为分析纯，试验用水为蒸馏水。1.3

仪器与设备

FW177型中草药粉碎机（天津泰斯特仪器公司）；DL-180智能超声波清洗机（上海之信仪器有限公司）；SHB－Ⅲ循环式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；WFJ2100型可见分光HH-4数显恒温水浴锅光度计（上海尼龙柯仪器有限公司）；（常州国华有限公司）；酸度计；酒精计；RE-52旋转蒸发仪（上海青浦沪西仪器厂）。实验中所用仪器均经过蒸馏水润洗。1.41.4.11.4.1.1

方法

标准曲线绘制

芦丁标准溶液的配制准确称取芦丁对照品0.0030g，

加少量70%乙醇，微热溶解后，置50mL容量瓶中，用同浓度浓度为6.0000mg/mL。准确吸取20.00mL，定容至乙醇定容。

50mL，摇匀，即得芦丁对照液，浓度为0.2400mg/mL。1.4.1.2

标准曲线绘制

准确吸取芦丁对照液0.00、0.20、

0.60、1.20、1.80、2.40、3.00mL，分别置于7支10mL具塞试精密加5%NaNO20.40mL，摇管中，用乙醇稀释至4.00mL，加10%Al（NO3）摇匀，静置6min，匀，静置6min后，30.40mL，再加入5%NaOH4.00mL，定容至10.00mL，静置15min，以

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恒温水浴锅中保温反应1h，在536nm波长处测其吸光度值，以0.5000mg/mL芦丁溶液作为对照样品，并用下式计算黄酮对羟基自由基的清除率：

用下式计算黄酮对羟基自由基的清除率：

1.4.3.6邻二氮菲-Tris-HCl缓冲液法此方法与1.5.1方法

其反应原理中不同的是用Tris-HCl缓冲液取代了磷酸缓冲，

与1.5.1方法中的反应原理相同。①在10mL容量瓶中依次

1.4.3.3

水杨酸-硫酸亚铁法[11]

此方法采用Feton体系产

加入Tris-HCl缓冲液2.00mL，1.5×10-3mol/LFeSO4溶液0.80mL，5mmol/L邻二氮菲2.00mL，用蒸馏水定容，摇匀，作为未损伤（A1）；②在10mL的容量瓶中依次加入Tris-HCl缓冲液2.00mL，1.5×10-3mol/LFeSO4溶液0.80mL，0.3%H2O21.00mL，5mmol/L邻二氮菲2.00mL，用蒸馏水定容，摇匀，作为损伤（A2）；③以Tris-HCl缓冲液2.00mL，黄酮样品提取液1.00mL，定容至10mL，作为样品参比（Axo）；④在10mL容量瓶中依次加入Tris-HCl缓冲液2.00mL，1.5×10-3mol/LFeSO4溶液0.80mL，黄酮样品提取液1.00mL，0.3%H2O21.00mL，再加入5mmol/L的邻二氮菲2.00mL，用蒸馏水定容，摇匀，作为加药（Ax）。将上述在536nm波各试液同时置于37℃恒温水浴锅中保温反应1h，

长处侧其吸光度值，以0.5mg/mL芦丁溶液为对照样品，并用下式计算黄酮对羟基自由基的清除率：

生羟基自由基，然后由体系中的水杨酸-乙醇捕捉羟基自由基并产生有色物质，此时，该有色物质在510nm波长处有最大吸收，但随着羟基自由基清除剂，即黄酮样品提取液的加入，有色物质会随之减少，在510nm波长处吸光度值也会减小，因此可计算黄酮样品提取液对羟基自由基的清除率。①以蒸馏水为空白参比；②未损伤（A1）：9mmol/LFeSO4溶液0.80mL（下同），9mmol/L水杨酸-乙醇溶液0.60mL，用蒸馏水定容至10.00mL，混匀作为未损伤；③损伤（A2）：9mmol/LFeSO4溶液0.80mL，9mmol/L水杨酸-乙醇溶液0.60mL，1%H2O21.00mL，用蒸馏水定容至10.00mL，混匀作为损伤；④样品参比（Axo）：9mmol/LFeSO4溶液0.80mL，9mmol/L水杨酸-乙醇溶液0.60mL，黄酮样品提取液1.00mL，用蒸馏水定容至10.00mL，混匀作为提取液本底吸光度值；⑤加9mmol/LFeSO4溶液0.80mL，9mmol/L水杨酸-乙醇溶液药（Ax）：

0.60mL，黄酮样品提取液1.00mL，1%H2O21.00mL，用蒸馏水定容至10.00mL，混匀作为加药。其中黄酮样品提取液是再取1.00mL加入。将上准确吸取1.00mL稀释至10.00mL，

述各试液同时置于37℃的恒温水浴锅中保温反应0.5h，在510nm波长处测其吸光度值。以0.5000mg/mL芦丁溶液为对照样品，并用下式计算黄酮对羟基自由基的清除率：

羟基自由基清除率=（A2-（Ax-Axo）×100

1.4.3.7

水杨酸-硫酸亚铁铵-蒸馏水法该方法与1.5.5方法非

常相似，所不同的是此方法中用蒸馏水代替了1.5.5中的Tris-HCl缓冲液，其反应原理同1.5.5。①未损伤（A1）：7.5mmol/L的硫酸亚铁铵溶液0.80mL，7.5mmol/L水杨酸0.80mL，用蒸馏摇匀；②损伤（A2）：7.5mmol/L硫酸亚铁铵溶水定容至10mL，

液0.80mL，7.5mmol/L水杨酸0.80mL，0.3%H2O21.00mL，用蒸馏水定容至10mL；③以1.00mL黄酮样品提取液用蒸馏（Axo）；④加药（Ax）：7.5mmol/L水定容至10mL作为样品参比

硫酸亚铁铵溶液0.80mL，7.5mmol/L水杨酸0.80mL，加0.3%H2O21.00mL，黄酮样品提取液1.00mL，用蒸馏水定容至10mL，摇匀。将上述各试液同时置于37℃恒温水浴锅中保温反应0.5h，在510nm波长处侧其吸光度值，以0.5000mg/mL芦丁溶液为对照样品，并用下式计算黄酮对羟基自由基的清除率：

调

查研究

A2

1.4.3.4罗丹明B法罗丹明B本身就是一种具有较深颜色

的物质，加入H2O2会产生羟基自由基。此时，在558nm波长处有最大吸收，但是随着黄酮样品提取液（羟基自由基的清除剂）的加入，有色物质会减少，此时吸光度值也会随之减小，因此可以检测并计算黄酮类化合物对羟基自由基的清除率。

在10mL的比色管中依次加入罗丹明B溶液（0.002%）1.60mL，H2SO4溶液（0.2mol/L）0.80mL，FeSO4溶液（0.4mmol/L）2.00mL，0.3%H2O2溶液0.60mL，摇匀，放置5min后加入2.00mL黄酮样品提取液，用蒸馏水稀释至刻度，测定其吸光度As，对照以溶剂代替样品液，其余步骤同前，在558nm波空白体系（罗丹明B和H2SO4溶液）长处测定其吸光度值A，

吸光度值A0。以0.5000mg/mL芦丁溶液为对照样品，并用下式计算黄酮对羟基自由基的清除率：

22.1

结果与分析

标准曲线与回归方程

结果见图１。回归方程为Ａ＝０．０１２２９＋０．３５９２７Ｖ，R＝０．９９９８７。

1.21.00.8

A=0.01229+0.35927V

R=0.99987

1.4.3.5水杨酸-硫酸亚铁铵-Tris-HCl缓冲液法[12]于10mL

A

比色管中依次加入7.5mmol/L的硫酸亚铁铵溶液0.80mL，7.5mmol/L的水杨酸-乙醇1.00mL，0.3%的H2O2溶液1.00mL，Tris-HCl缓冲液2.00mL，最后加入黄酮样品提取液1.00mL，然后在37℃的恒温水浴锅中保温反应0.5h，在510nm波长处测其吸光度值。以0.5000mg/mL芦丁溶液为对照样品，并

0.60.40.20.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

V/mL

图1芦丁回归曲线

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2.2总黄酮含量的测定清力，而第1种方法中黄酮对羟基自由基的清除能力最低，除率只有4.3%。

参考文献：

结果见表1。

表1

黄芩总黄酮含量

118.196

218.274

318.235

418.018

518.341

18.213

［１］崔璐，路俊仙，林慧彬，等.我国黄芩资源及生产现状

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结果表明，黄芩中总黄酮含量为18.213mg/g。2.3

不同方法黄酮对羟基自由基的清除方法比较

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结果见图2。

图2黄芩中黄酮对羟基自由基的清除率

调

查研究

结果表明，黄芩中黄酮对羟基自由基具有一定的清除率，但不同方法对羟基自由基却有不同的清除能力，用水杨酸-硫酸亚铁铵-Tris-HCl缓冲液法时，黄芩中黄酮对羟基自由基的清除率最高，可达67.0%，而使用邻二氮菲-磷酸同时也可以看出，在有些缓冲液法时清除率最低，只有4.3%，方法中黄芩总黄酮对羟基自由基的清除率比芦丁小，而在有些方法中，黄芩总黄酮对羟基自由基的清除能力要强于芦丁。33.13.2

结论

采用NaNO2-Al（NO3）在510nm波3-NaOH分光光度法，黄酮类化合物具有较强的清除自由基的能力，对羟基

长下测量黄芩中黄酮总含量为18.213mg/g。

自由基具有一定的清除率，使用不同方法，黄酮对羟基自由基就具有不同的清除能力，由图2中可以看出，在以上7种方法中使用第5种方法（水杨酸-硫酸亚铁铵-Tris-HCl缓冲液法）黄芩中黄酮对羟基自由基的清除能力最强，清除率可达67.0%，且强于相同方法中芦丁对羟基自由基的清除能

ExtractionofTotalflavonoidsfromScutellariabaicalensisGeorgiand

ComparisonofHydroxylFreeRadicalScavenging

FENGLei,WUDong-qing,WANGYong-sheng,ANHong-gang,WANGJun-xia,RENXue-feng

(DepartmentofChemistry,HexiUniversity,ZhangyeGansu734000,China)

Abstract:Using60%ethanolassolventtoextracttotalflavonoidsfromScutellariabaicalensisGeorgibyrefluxextractiontechnology.RutinwasusedasastandardcontroltodeterminethecontentsoftotalflavonoidsinScutellariabaicalensisGeorgibySpectrophotometry.Theremovalabilityoftheextracttohydroxylradicalwasalsoevaluated.TheresultsshowedthatflavonoidsfromScutellariabaicalensisGeorgihaddifferentremovalabilitytohydroxylradicalbydifferentmethods.Itwasfoundthatthebestremovaleffectwasthemethodwhichused0.80mLofammoniumferroussulfatesolution(7.5mmol/L),1.00mLofsalicylicacid-ethanol(7.5mmol/L),1.00mLofH2O2solution(0.3%)and2.00mLofTris-HClbuffer.Keywords:ScutellariabaicalensisGeorgi;flavonoids;hydroxylradical