枯草芽孢杆菌产淀粉酶条件的优化

第50卷第11期第年期116月2011

湖北农业科学

Vol．50No.11

Jun．，2011

HubeiAgriculturalSciences

枯草芽孢杆菌产淀粉酶条件的优化

赵望锋1，周

（1．滨州学院经济与管理系，山东滨州

晶2

273165）

256600；2．曲阜师范大学生命科学学院，山东曲阜

摘要：以枯草芽孢杆菌为试验菌株，采用液态培养基发酵，探讨枯草芽孢杆菌产α－淀粉酶的最佳发酵条件，分别对碳源、氮源、发酵时间、接种量、培养基初始pH进行单因素试验，在此基础上对碳源浓度、氮源浓度、接种量、培养基初始pH这4个因素进行了L9（34）正交优化试验。结果表明，葡萄糖优于其他碳源，尿素优于其他氮源，最佳培养时间为30h；最佳发酵参数组合为pH5．0，葡萄糖质量浓度0．2％，尿素质量浓度1．5％，接种量2．5％。

关键词：枯草芽孢杆菌；α－淀粉酶；最佳发酵条件；正交试验中图分类号：S816．3

文献标识码：A

文章编号：0439－8114（2011）11－2315-03

OptimationofFermentationConditionsofAmylasebyBacillussubtilis

ZHAOWang－feng1，ZHOUJing2

（1.DepartmentofEconomicsandManagment，Binzhou256600，Shandong，China；

2.CollegeofLifeScience，QufuNormalUniversity，Qufu273165，Shandong，China）

Abstract：Singalfactorandorthogonalanalysiswereappliedtoobtaintheoptimalconditionsforfermentingα－amylasebyBacillussubtilisinliquidculturemedium．Fivefactors，carbonsource，nitrogensource，originalpH，incubationtimeandin-oculumsizeweretestedrespectively；andbasedonthesesinglefactortests，thecarbonconcentration，nitrogenconcentration，originalpHvalueandinoculumsizewereanalyzedinL9（34）orthogonalanalysis．Theresultshowedthattheoptimalcarbonsourceandnitrogensourcewereglucoseandcarbamide，respectively．Theoptimalincubationtimewas30h．Theoptimalpa-rameterwasoriginalpHvalue，5．0；carbonconcentration，0．2％；nitrogenconcentration，1．5％；andinoculumsize，2．5％．Keywords：Bacillussubtilis；α－amylase；optimalfermentalcondition；orthogonalanalysis

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称，广泛存在于动植物和微生物中。α－淀粉酶以内切方式水解淀粉底物的α－1，4糖苷键，水解产物为寡聚糖、麦芽糖和葡萄糖［1］，被广泛应用于酒精发酵、啤酒酿造、葡萄糖制造、糊精制造、糖浆制造、纺织品退浆、铜版纸加工、洗衣业、饲料加工及医药生产等领域［2］。用于工业生产α－淀粉酶的主要生物为芽孢杆菌（Bacillaceae）［3］，其中枯草芽孢杆菌（Bacillus

1

材料和方法

1．1试验材料

1．1．1菌种枯草芽孢杆菌分离自山东省曲阜市

污水处理厂。

1．1．21．1．3

培养基种子培养基为牛肉膏蛋白胨培养

磷酸氢二钠－柠檬

基；发酵培养基用牛肉膏蛋白胨液体培养基。

主要试剂和溶液的配制

酸缓冲液（pH6．0）：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·

subtilis）广泛存在于土壤、水中，由于其产酶量高、种

类多、安全性好和环保等优点，在现代工业生产中被广泛应用［4］，本试验通过研究枯草芽孢杆菌产淀粉酶的影响因素，探讨最佳发酵条件，为α-淀粉酶在实际生产中的广泛应用提供依据。

12H2O）45．23g、柠檬酸（C6H8O7·H2O）8．07g，用蒸馏

水溶解并定容至1000mL。配好后用pH计校正。质量浓度为2％的淀粉溶液：称取可溶性淀粉2．0g，用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入煮沸的水中，加热煮沸

收稿日期：2010－12－03

基金项目：山东省优秀中青年科学家奖励基金项目（2008BS09011）；山东省自然科学基金项目（2009ZRB01461）

作者简介：赵望锋（1981－），男，山东莱芜人，助教，硕士，主要从事微生物生态学教学和研究，（电话）0543－3191175（电子信箱）

zhaowangfeng00＠163．com。

2316

湖北农业科学2011年

至透明，冷却后定容至0．1L。果绘制图1。可以看出，4种碳源对酶活力影响不同，葡萄糖作为碳源时，淀粉酶活力最大，但是与牛肉膏作碳源时酶活力差异不显著，显著高于蔗糖和淀粉作为碳源的酶活力（P＜0．05）。所以，葡萄糖和牛肉膏可以作为最佳碳源。

62.061.67861.561.060.560.059.559.058.558.0

61.340

1．21．2．1

试验方法粗酶液制备

将枯草芽孢杆菌接种在种子

培养基上，37℃培养12h，使其活化；将活化的枯草芽孢杆菌接种于发酵培养基中，37℃恒温培养24h后用漏斗过滤，取上清液，即为待测粗酶液。

1．2．2淀粉酶活力测定采用碘－淀粉法［5］测定酶

酶活力//mg/h

活力：吸取2．0mL质量浓度2％的淀粉溶液于试管中，加入磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液1．0mL，摇匀，于40℃恒温水浴保温5min。加入粗酶液1．0mL，

59.352

59.508

40℃保温30min后，加入0．5mol／L乙酸溶液5．0mL，混匀。吸取反应液1．0mL，加稀碘液5．0mL，混

合均匀。以蒸馏水作为空白参比，于660nm波长测定其吸光度（A）。从标准曲线算出被酶消耗的淀粉量。酶活力以每毫克粗酶液在40℃，pH6．0条件下每小时所分解的淀粉质量来衡量。

图1

葡萄糖牛肉膏

碳源

蔗糖淀粉

不同碳源对枯草芽孢杆菌产淀粉酶的影响

2．2氮源对菌体产淀粉酶的影响

测定不同氮源培养基产淀粉酶的活力，根据结

1．2．3单因素试验在牛肉膏蛋白胨液体培养基果绘制图2。可以看出，氮源的不同对酶活力具有一定的影响，所产酶活力尿素＞蛋白胨＞硝酸铵＞硫酸铵，且尿素做氮源和其他3种氮源对酶活力的影响差异显著（P＜0．05），硝酸铵与硫酸铵对酶活力的影响没有显著差异。

80

7065.[**************]0

75.132

60.668

60.364

基础上，分别改变培养基碳源、氮源、pH、接种量和培养时间，考察各因素对菌体产淀粉酶活力的影响。①改变培养基碳源为相同质量浓度的葡萄糖、蔗糖、牛肉膏或淀粉，接种量1．88％，其他培养条件不变，测定各培养基产淀粉酶的差异。②以葡萄糖为碳源，改变培养基氮源为相同质量浓度的蛋白胨、尿素、硝酸铵或硫酸铵，接种量1．88％，其他培养条件不变，测定各培养基产淀粉酶的差异。③以葡萄糖为碳源，尿素为氮源，接种量1．88％，测定pH分别为5．0、6．0、7．0、8．0时各培养基产淀粉酶的差异。④以葡萄糖为碳源，尿素为氮源，调节各培养基初始pH为7．0，测定每40mL发酵培养基分别接种

酶活力//mg/h

蛋白胨尿素硝酸铵硫酸铵

氮源

400、600、800、1000μL种子培养基时产淀粉酶的差

异。⑤以葡萄糖为碳源，尿素为氮源，调节培养基初始pH为7．0，接种量1．88％，培养12h后，每隔6h测1次酶活性，测定不同培养时间对菌体产淀粉酶的影响。单因素试验中每个处理均设置3个重复。

图2不同氮源对枯草芽孢杆菌产淀粉酶的影响

2．3初始pH对菌体产淀粉酶的影响

考察不同初始pH对菌体产淀粉酶的影响，根

据结果绘制图3。由图3可以看出，不同初始pH条件下产生的酶活力有差异，初始pH为7．0时产生的淀粉酶活力最大，但是在P＝0．05水平上，各处理组酶活力差异不显著，pH在5．0～7．0（中性偏酸）时，酶活相对较大。

1．2．4正交试验在上述单因素试验基础上，对葡

萄糖浓度、尿素浓度、初始pH和接种量4因素作了

3水平的正交试验，各因素及水平见表1。

表1

水平

初始pH

正交试验因素与水平

尿素浓度//%

接种量//%

葡萄糖浓度//%

123

5.06.07.0

0.20.30.4

0.51.01.5

1.52.02.5

2

2．1

试验结果

碳源对菌体产淀粉酶的影响

测定不同碳源培养基产淀粉酶的活力，根据结

56.256.055.8

55.655.56055.455.255.054.8

5.0

55.928

56.080

酶活力//mg/h

55.316

6.0

pH

7.08.0

图3初始pH对枯草芽孢杆菌产淀粉酶的影响

第11期赵望锋等：枯草芽孢杆菌产淀粉酶条件的优化2317

正交试验结果

尿素浓度

接种量

酶活性//mg/h

2．4接种量对菌体产淀粉酶的影响

测定不同接种量条件下产生淀粉酶的活力，根

序号

表2

pH[1**********].00973.49171.7993.210

葡萄糖浓度

据结果绘制图4。可以看出，接种量不同，酶活力不同，不同接种量所产生淀粉酶的活力大小顺序为：

1234567

[1**********].68573.66472.9490.736

[1**********].47273.84773.9801.508

[1**********].44072.63574.2241.589

74.30874.85675.86474.94874.27671.24871.80071.86071.736

800μL、600μL、1000μL、400μL，其中800μL接

种量产生的酶活力显著高于与其他3个接种量（P＜

0．05）。

69686766

6564.584646362

400

68.000

65.868

65.408

89123R

酶活力//mg/h

6008001000

接种量//μL/40mL

图4不同接种量对枯草芽孢杆菌产淀粉酶的影响

需要的温度，保证各试管温度一致，避免因水温引起的误差；②取样时，速度要快、准确，避免样品损失带来的误差；③酶反应时，先往反应管中加底物溶液，后加酶提取液，而且一次不要做太多的样品，以避免加样先与后的时间差异对试验结果的影响；

2．5培养时间对菌体产淀粉酶的影响

考察不同培养时间所产淀粉酶的活力，根据结

果绘制图5。可以看出，枯草芽孢杆菌产淀粉酶不同培养时间酶活力不同，30h和36h的酶活性在P＝

0．05水平上差异不显著，但是显著高于24、18、42h的酶活力（P＜0．05）。因此，最适培养时间是30h，在30h以内酶的活性随着时间的延长而升高，30h

后，所产酶的活性开始下降。

686766

6564.[1**********]59

18

67.24466.752

65.620

④加入乙酸，隔一段时间待乙酸完全终止反应后，再测吸光值；⑤测定吸光值时，先要检查比色杯是否有差异，避免因比色杯差异引起的误差；⑥用移

液管量取液体时，应及时用蒸馏水冲洗，避免酶液间相互影响。

研究从碳源、氮源、培养基初始pH、接种量、培养时间5个单因素对枯草芽孢杆菌产α－淀粉酶的影响进行了探讨，得出枯草芽孢杆菌在葡萄糖作为碳源，尿素作为氮源，培养基初始pH在5～7，接种

酶活力//mg/h

61.860

量为2．5％，培养时间为30h时，产生的淀粉酶活力相对较高。经正交试验分析，采取培养基初始pH

2430培养时间//h

3642

5．0，葡萄糖质量浓度0.2％，尿素质量浓度1．5％，接

种量2．5％这种方案时枯草芽孢杆菌产生的淀粉酶活力最高。

枯草芽孢杆菌生产的蛋白酶、淀粉酶是工业酶中应用最为广泛的酶，二者就占到了整个工业酶市场的50％［7］。我国酶制剂工业近年来取得了长足的发展，但仍无法跟上世界同行业发展的步伐，科研乏力已成为制约中国酶工业发展的瓶颈因素。枯草芽孢杆菌作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已被广泛应用于工业、农业、医药卫生、食品、畜牧业、水产等领域。随着经济的发展、科研水平的提高，枯草芽孢杆菌与人们日常生活的关系将更为密切，它也必将作为一种十分重要的工业微生物菌种越来越引起人们的关注和青睐。本试验通过研究枯草芽孢杆菌产淀粉酶的若干影响因素，进而确定其产酶的最佳条件，为α-淀粉酶

图5培养时间对枯草芽孢杆菌产淀粉酶条件的影响

2．6正交试验

在单因素试验基础上，对葡萄糖浓度、尿素浓

度、初始pH、接种量4因素作3水平的正交试验。由表2可以看出，对产酶活性影响最大的是培养基初始pH，其次是接种量和氮源浓度，葡萄糖浓度影响最小；最佳方案是pH5．0，葡萄糖质量浓度

0．2％，尿素质量浓度1．5％，接种量2．5％。

3

3．1

讨论与结论

淀粉酶活力测定时的注意事项

酶活力测定受多种因素影响［6］，测定过程中应

注意以下几点：①取样前，要把水浴锅的水温调到

第50卷第11期

2011年6月

湖北农业科学

湖Hubei北Agricultural农业Sciences科学Vol．50No.11

年2011Jun．，2011

柴达木盆地黑果枸杞色素最佳提取工艺研究

孙

奎

810016）

（青海省农林科学院，西宁

摘要：以黑果枸杞果实为原料，乙醇为提取剂，探讨了乙醇浓度、提取时间、料液比、提取温度等单因素对黑果枸杞色素提取效果的影响；在单因素试验的基础上，通过L16（45）正交试验，确定黑果枸杞色素的最佳提取工艺。结果表明黑果枸杞色素的最佳提取工艺为乙醇体积分数50％，提取时间60min，料液比

1∶12，提取温度50℃。

关键词：黑果枸杞；色素；提取中图分类号：R151．3

文献标识码：A

文章编号：0439－8114（2011）11－2318-03

StudyontheExtractingTechnologyofPigmentsfromLyciumruthenicumin

QaidamBasin

SUNKui

（QinghaiAcademyofAgricultureandForestry，Xining810016，China）

Abstract：TakingfreshLyciumruthenicumfruitasrawmaterial，ethanolasextractionsolvent，theeffectofethanolconcen-tration，extractiontime，temperatureandsolidtoliquidratioonextractingefficiencyofpigmentwasinvestigatedbysinglefactortestandL16（45）orthogonalexperiment．Theresultshowedthattheoptimumextractingconditionswere50％（V/V）ethanol，extractingfor60minwiththesolidtoliquid1∶12，at50℃．Keywords：Lyciumruthenicum；pigment；extraction

黑果枸杞（LyciumruthenicumMurr．）是茄科枸杞属的多年生落叶灌木，其味甘、性平、清心热，藏药称为“旁玛”，用于治疗心热病、心脏病、月经不调、停经等病症，药效显著，收载于《四部医典》、《晶珠本草》等藏医药经典著作。黑果枸杞果实中有大量的紫色物质，该物质溶于水中，有较强的浸染能力，具有良好的耐热耐光耐酸能力，是一种良好的

天然色素资源，可用于食品、医药、化妆品等工业中，具有广阔的发展前景［1，2］。关于黑果枸杞的色素提取工艺，国内已有初步的报道，但之前的研究多以果实干粉为原材料，在干燥过程中易造成色素的损失［3－5］，本文以冷藏的黑果枸杞鲜果为原材料，用乙醇溶液为提取剂，通过单因素试验和正交试验，对黑果枸杞色素的提取工艺进行了研究，确定其最

收稿日期：2010－12－15

基金项目：青海大学中青年基金项目（2009－QN－06）作者简介：孙

奎（1976－），男，新疆奎屯人，助理研究员，硕士，主要从事植物资源开发与利用方面的研究，（电话）[1**********]（电子信箱）samsk＠126．com。

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在实际生产中的广泛应用提供依据。

参考文献：

［1］谷

军．Α—淀粉酶的生产与应用［J］．生物技术，1994，4（3）：1－5．

［2］邱发福．真菌α—淀粉酶在面粉生产中的应用［J］．粮油食品科

技，1999，7（4）：22－23．［3］杨［4］马

慧，王振华，潘康成，等．芽孢杆菌产淀粉酶活性的研究［J］．明，杜金华．枯草芽孢杆菌酶在工业生产中的应用［J］．山现代农业科技，2007（2）：90－93．

东科学，2006，19（3）：35－38．

［5］刘贺红，万金泉，马邕文，等．DNS比色法测定污泥中淀粉酶活

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霞，黄卓烈．1，4－环氧六环对α－淀粉酶催化活性的影响丽．枯草芽孢杆菌在养殖中的应用［J］．渔业现代化，2002［J］．河北化工，2008（12）：40－41．（4）：1．

（责任编辑向闱）