实验17 溶菌酶蛋白质含量测定
实验17 溶菌酶蛋白质含量测定
一、 实验目的
1、 学习溶菌酶蛋白质含量测定原理
2、 掌握溶菌酶蛋白质含量测定方法
二、 实验原理
Folin 一酚试剂法(Lowry)法
用于蛋白质测定的lowy 反应是双缩脲方法的发展，第一步涉及到在碱性溶液中铜一蛋白质复合物的形成，然后这个复合物还原磷钼酸——磷钨酸试剂(Fo1in)，产生深蓝色(铜蓝和钨蓝混合物) 。这个测定法较双缩脲法灵敏得多，但要费较长时间。对双缩脲反应发生干扰的离子同样容易干扰此作用。浓度较低的尿素(约有0.5％左右) 、胍(0.5％左右) 、硫酸钠(1％) 、硝酸钠(1％) 、三氯乙酸(0.5％) 、乙醇(5％) 、乙醚(5％) 、丙酮(0.5％) 等溶液对显色无影响，这些物质浓度高时必须做校正曲线。含硫酸铵的溶液只须加浓碳酸钠一氢氧化钠溶液即可显色测定。若样品酸度较高，显色后色浅，则必须提高碳酸钠------氢氧化钠溶液的浓度1—2倍。
进行测定时，加Folin 氏试剂要特别小心，因为Folin 氏试剂仅在酸性pH 条件下稳定，但上述还原反应只是在pH10试剂的情况下发生，故当Folin 氏试剂加到碱性的铜一蛋白质溶液时，必须立即混匀，以便在磷钼酸一磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应 即能发生。
此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。
三、 实验试剂及材料仪器
试剂：
1. 标准蛋白质溶液：可用结晶牛血清蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氨法测定 蛋白氨，根据其纯度配制成250ug ／ml 的溶液。
2．Folin 一酚试剂的配制(均用分析纯试剂) ：
试剂甲：由下述四种溶液配制的。(1)4％碳酸钠(Na2CO 3) 溶液；(2)0.2N氢氧化钠溶液；(3)1％硫酸铜(CuS04. 5H2O) 溶液；(4)2％酒石酸钾钠溶液(或酒石酸钾、酒石酸钠) 。在使用前，将(1)与(2)等体积混合配成碳酸钠一氢氧化钠溶液，将(3)与(4)等体积混合配成硫酸铜一酒石酸钾钠溶液。然后将这两种溶液按50：1的比例混合，即为Folin 一酚试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。
试剂乙(Folin)氏试剂) ：在2升的磨口回流装置内加入100克钨酸钠(Na2WO 4．2H 20) ，25克钼酸钠(Na2MoO 4。2H 2O) ，700ml 蒸馏水，再加50ml 85％磷酸及100ml 浓盐酸，充分混合后，以小火回流10小时。再加入150克硫酸锂(Li2SO 4) ，50ml 蒸馏水及数滴液体溴。然后开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后定容到lL 。过滤，滤
液微呈绿色，置于棕色试剂瓶中冰箱保存。使用时用标准氢氧化钠溶液滴定，以酚酞为指示剂，而后适当稀释(约1倍) ，使最后浓度为1N 酸，此为Folin---酚试剂乙应用液。贮于冰箱中可长期保存。
器材：
1．721型分光光度计。
2．恒温水浴。
四、实验方法
1、样品测定：
取lml 样品溶液(约含20—250 ug多肽或蛋白质) ，加入5ml 试剂甲，混匀，于 20—25"C 放置10分钟。再加入0.5ml 试剂乙(Folin氏试剂) ，立即振摇均匀，在20—25"C 保温30分钟，然后于500nm 处比色。以1ml 水代替样品作为空白对照。
二、标准曲线的制备：
取14只试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml 标准蛋白质溶液（250ug ／ml ），用水补足到1ml ，然后按上述方法进行操作测定光密度值，取两组测定的平均值，以蛋白质浓度为横座标，光密度值为纵座标，绘制标准曲线作为定量的依据。
若用0.5cm 光程的比色池进行比色，可按下面方法进行操作：取0.2ml 样品溶液(约含6－100ug 多肽或蛋白质) ，加入1ml 试剂甲(可选用0.3—0.5厘米直径的小试管) ，混匀，l0分钟后再加0.1ml 试剂乙，立即摇匀，30分钟后比色。若多肽或蛋白质浓度在5—25ug ，则波长用755nm ，25ug 以上则采用500nm 比色为宜。
五、实验报告
根据实验写出实验报告