非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验修改版
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验
一 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
配制溶液：
1、30% Acrylamide（14.5 g 丙烯酰胺，0.5g 双丙烯酰胺，加水溶解，定容至50 ml，4℃，棕色瓶中储存）
2、 10% 过硫酸铵 （0.5g APS，溶于5ml 去离子水中，4℃可储存数个月）
3、 10 ×TBE 缓冲液（10.8g Tris,0.744g EDTA,5.5g 硼酸，定容到100ml）
4、TEMED
5、20-200 DNA marker
实验步骤：
1、 配置10%的胶 10ml： 5.5 ml water
3.3ml 30% Acrylamide
1ml 10 ×TBE
0.11ml APS（现配现用）
0.01mlTEMED
2、 立即将胶倒入两块板间并插好梳子，放置，待凝固30min，时间可以适当延长。
3、 向电泳槽加入1×TBE，拔出梳子并用注射针筒多次洗涤点样孔，尽可能排除未聚合的丙烯酰胺。
4、 将DNA marker 加到点样孔中，以120V（10V/cm）进行电泳直到燃料走到靠近底部的三分之一处，大约需要60-90分钟。
二 银染实验
银染溶液的配置：实验之前准备4℃水
1、 固定液（10%醋酸）：20ml冰醋酸，180mlddH2O混匀（通风厨中进行）
2、 染色液：将0.1g AgNO3溶解于100 ml ddH2O中，使用前加0.15ml37%甲醛溶液，必须储存于避光瓶中，防止接触皮肤（通风厨中进行）
3、 显影液：将6gNa2CO3溶解于200ml ddH2O中，冷却至4℃， 使用前加0.3ml37%甲醛溶液（通风厨中进行）
30μl 0.1M五水硫代硫酸钠；（0.1M Na2S2O3。5H2O：将1.24g Na2S2O3。5H2O溶于50mlddH2O）。放入冰箱中冷却到4摄氏度。
注意事项：
1、 染色液和显影液要现用现配；
2、 显影液必须在4℃使用且必须保存在4℃；
3、 甲醛蒸汽致癌，在通风厨内操作；
4、 实验室中柔和的背景光线有利于降低背景颜色；
5、 显色不能在透光的盒子中进行；
6、 溶液不能直接倒在胶面上，应使盘倾斜后将溶液倒在盘的角上，或者将每种溶液各方一盘，然后将胶从一个盘转到另一个盘；
7、 溶液的体积必须足够将胶全部浸没；
8、 显色过程中盘中须轻轻摇动。
实验步骤：
1、 固定：用刀子轻轻分开玻璃板，将带有凝胶的一块玻璃板放入盛有200ml固定液的盘子中，放在水平摇床上摇动20min或直至染料带完全消失
2、 洗涤：把固定液倒回大烧杯中，然后用ddH2O清洗三次，每次2min
3、 染色：把玻璃板放在盛有100ml染色液的盘子里，在水平摇床上摇动30min
4、 显影：把玻璃板在预冷ddH2O中快速过一下（不超过10s），迅速放入预冷（4℃）的显影液中，显色3-5min或直至所有的带都出现
5、 停止：当出现清晰的条带时，加入先前用过的500ml固定液轻轻摇动，停止显影
6、 用ddH2O将凝胶洗2次，每次2min
7、 晾干，扫描
8、 拍照观察