高效液相色谱法测定鱼腥草素对鸭肝脂肪酸合成酶活性的影响
第37卷
分析化学(FE NX I HUAXUE ) 研究简报第5期
2009年5月Chinese Journal of Analytical Che m istry 729~732
高效液相色谱法测定鱼腥草素对鸭肝脂肪酸合成酶活性的影响
许理 李学刚 陈竹 张飞 叶小利
1
1221
31
(西南大学生命科学学院, 重庆400715) 2(西南大学药学院药用资源化学研究所, 重庆400716)
摘 要 利用高效液相色谱法对肉鸭肝脏中参与脂肪酸合成关键酶———脂肪酸合成酶的活性进行分析, 并测定了鱼腥草素对鸭肝脂肪酸合成酶活性的影响。采用离心法从鸭肝中分离纯化脂肪酸合成酶, 并用鱼腥草
素(100mg/L) 处理脂肪酸合成酶, 然后用HP LC 法检测还原型NADPH 在340n m 处吸收峰变化。HP LC 最佳测定条件为:Hypersil C 18色谱柱, 流动相:0. 01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7. 2) 2甲醇溶液(80∶20, V /V) , 柱温:
25℃, 流速:1mL /min, 检测波长:340n m, 进样量:20μL 。HP LC 加样的回归方程:A =17754x +123. 3, r =019945。实验结果表明, 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH ) 浓度在0. 5μmol/L~1. 44mmol/L内线
性关系良好。HP LC 法检测鸭肝脂肪酸合成酶的活性, 样品用量少, 准确度高。关键词 鱼腥草素同系物, 脂肪酸合成酶, 活性, 高效液相色谱
1 引 言
脂肪酸在细胞中被用作能量存储化合物、(fatty
[1][2]
acid synthetase, F AS, EC 2. 3. 1. 85) , 、
[3][4][5][6]
脂质沉积、肥胖、高血脂症、抗癌、抗菌(HOU 2C n ) 可能是一种新型的F AS 抑制剂F AS 是由7种酶和1) , 能催化乙酰辅酶A 和丙二酰辅酶A 经过7, :
+7CoA +14NADPH +14H ++7ATP
脂肪酸合成酶复合体
[7, 8]
软脂酸+8CoAS H +14NADP ++7ADP +7Pi +7H 2O +7C O 2
[9]
(1)
目前测定F AS 活性的方法主要包括:紫外分光光度法, 在340nm 处检测还原型烟酰胺腺嘌呤二
核苷磷酸(NADPH ) 含量的变化, 但此法反应条件难以控制, 如果药品本身有颜色, 会造成测定结果的不
14[2]14
准确, 同时每个反应最少需要样品2mL, 所需底物量大, 实验成本高; C 示踪法, 检测[C ]乙酰2CoA 含量的变化。此法所用试剂价格昂贵, 要求示踪设备, 一般实验室难以实现, 不适合广泛的应用。于刚[10]
等用HP LC 法检测反应体系中NADPH 浓度的变化, 建立了测定H MG 2CoA 还原酶活性的HP LC 分析方法。由于H MG 2CoA 还原酶催化的反应为一步反应, 反应底物和产物明确, 因此, 用HP LC 法检测结果线性关系好。而F AS 催化软脂酸合成是多步复杂反应, 因此, 本研究尝试利用HP LC 法检测HOU 2C n 对鸭肝脂肪酸合成酶反应体系中NADPH 含量变化的影响, 建立简单可靠的针对多酶反应体系的新的测定F AS 活性方法和寻找新型F AS 抑制剂。
2 实验部分
2. 1 仪器与试剂
LC 26AD 高效液相色谱仪, SP D 2M20A 紫外检测器(日本岛津公司) ; 高速冷冻离心机(美国Beck man
公司) 。乙酰辅酶A 、丙二酰辅酶A 和NADPH (纯度≧97%, 美国Sig ma 公司) ; 实验用水为二次蒸馏水。2. 2 实验方法2. 2. 1 流动相选择 通过对比在磷酸盐溶液中添加不同体积的甲醇(磷酸盐溶液和甲醇的体积比分别为:90∶10, 70∶30, 50∶20∶80) 发现, 采用0. 01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7. 2) 2甲醇(80∶20, V /V) 体
2008209225收稿; 2008212208接受
本文系国家自然科学基金(No . 20673084) 、重庆市自然科学基金(CSTC . 2008BB5257) 和重庆市科技攻关重大项目(CST C . 2008AA5021) 资助3E 2mail:yexiaoli2002@yahoo . com. cn
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分析化学第37卷
系对样品进行分析检测, 峰型良好, 能达到预期理想的分析结果。2. 2. 2 色谱条件 SP D 2M20A 紫外检测器, Hypersil C 18色谱柱(200mm ×4. 6mm, 5μm ) , 流动相:0. 01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7. 2) 2甲醇溶液(80∶20, V /V) , 柱温:25℃, 流速:1mL /min, 检测波长:340nm , 进样量:20μL 。2. 2. 3 标准溶液 分别称取1mg 乙酰辅酶A, 3. 6mg 丙二酰辅酶A, 4. 3mg NADPH, 配成016、214和214mmol/L标准溶液, 用前稀释; 准确称取合成鱼腥草素同系物(C n H 2n +1C (O ) CH 2C (OH ) S O 3Na, n =8, 10, 12, 14, 16; 简写为HOU 2C n ) 各0. 01g, 于100mL 容量瓶中, 先加入少量1%T ween 280(吐温280) 溶解, 如溶解不完全可80℃加热, 然后用1%T ween 280定容到100mL, 作为浓度为100mg/L的储备液于冰箱中4℃保存备用。2. 2. 4 鸭肝脂肪酸合成酶的制备 鸭肝脂肪酸合成酶制备参考文献[11]的方法, 并作了部分改进:取4g 肝脏(此前浸泡在0. 25mol/L蔗糖和1mmol/LE DT A 22Na 溶液中) , 用生理盐水冲洗3次(每次10~20mL ) , 电动匀浆(10000g, 每次30s ) , 9800r/min 离心10m in, 使细胞核及线粒体成分沉淀; 取上清液, 12000r/min 离心30m in 。将上清液用0. 25mol/L蔗糖和1mmol/LE DT A 22Na 溶液稀释3倍, 作为脂肪酸合成酶活性测定的酶液。所有的操作都在4℃条件下进行。
[10]
2. 2. 5 HPLC 法测定HO U 2C n 对鸭肝脂肪酸合成酶的影响 按表11. 5mL 离心管中。在37℃下反应5m in, 然后用500μL 0. 5Na OH 。10000r/min 离心5m in 。取上清液20μL 进样, 测定NADPH 表1 反应体系的配制
Table 1 Preparati on of reacti on syste m
组别
Gr oup
Phos phate buffer
(μL )
(μL ) 10
Mal 2(μ)
101010
Acetyl 2CoA (μL )
101010
F AS (μL ) \55
HOU 2C n (μL )
\\5
空白组B lank 酶对照组抑制剂组I l ogues .
NADPH:β2dinudeotide 22′2phos phate reduced tetras odium; F AS:fatly acid synthetase; HOU 2C n :houttuyfonatehomo 2
脂肪酸合成酶催化的脂肪酸合成反应中, 底物中NADPH 被氧化, 还原型NADPH 在340n m 处有一
[9]
个吸收峰, 而氧化型则无此吸收峰, 测定单位时间内340n m 光密度的减少可反映脂肪酸合成酶的活性。而本实验中通过HP LC 测定NADPH 的峰面积的减少来测定脂肪酸合成酶的活性。在上述测定条件下单位时间内合成1n mol/L软脂酸(即14n mol/LNADPH 被氧化) 所需酶蛋白的量即为一个活性单位脂肪酸合成酶的活性(U ) 。反应前样品中NADPH 的浓度C 1为240μmol/L,峰面积A 1=43891, 反应后样品中NADPH 的峰面积A 2=5267。所以样品中反应后NADPH 的浓度C 2=C 1A 2/A1=29μmol/L,从鸭肝中提
) =3014U 。取的F AS 的活性[n mol/L/(m in ・mg ) ]=NADPH被氧化的量/14(反应时间t ×蛋白浓度ρ
2. 2. 6 计算相对抑制率 在反应(1) 中, 当加入HOU 2C n 时, 脂肪酸合成酶的活性受到抑制, NADPH 反应的量减少, 因此, 通过HP LC 测定反应前后NADPH 量的变化来评价HOU 2C n 对脂肪酸合成酶的相对抑制率R 。计算公式为:
(2) R (%) =100×(S 抑制剂-S 对照) /(S 空白-S 对照)
式中, S 空白、S 对照和S 抑制剂分别为空白组、酶对照组和抑制剂(HOU 2C n ) 组中NADPH 的峰面积(mAU ・s ) 。
3 结果与讨论
3. 1 酶促反应与时间的关系
从图1可知, 在15m in 内, 随着反应时间的延长, NADPH 的浓度呈线性单调下降; 15m in 后, NAD 2PH 的下降率减缓。因此, 本条件下反应时间确定为15m in 以内。3. 2 线性关系及检测限
配制浓度为1440、960、480、240、120、50、10、5. 0、1. 0、0. 5和0. 1μmol/LNADPH 溶液, 离心后进样。结果显示, 当NADPH 的浓度大于0. 5μmol/L时, NADPH 的峰面积A 与浓度C 呈良好的线性关
第5期许理等:高效液相色谱法测定鱼腥草素对鸭肝脂肪酸合成酶活性的影响
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系, 线性回归方程为:A =17754C +123. 3, r =0. 9945。结果
表明, NADPH 浓度在0. 5~1440μmol/L的范围内线性关系良好。当NADPH 的浓度低于0. 5μmol/L时, 吸收峰面积较小, 相对误差增大, 曲线逐渐偏离标准曲线, 即定量下限为0. 5μmol/L。3. 3 色谱分析
从图2可知, HP LC 能实现NADPH 的良好分离, 峰形规则。在整个反应中保留时间较稳定。a 组为空白组, 此
图1 NADPH 的浓度与反应时间的关系时NADPH 的峰面积表示体系反应前NADPH 的最大浓度。 Fig . 1 Relati onshi p bet w een reacti on ti m e and
b 组中NAP DH 的峰面积迅速减少, 表明脂肪酸合成酶与
concentrati on of NADPH
NADPH 充分反应, 使体系中余下较少的NADPH 。c 组为
添加鱼腥草素同系物后体系中的NADPH 量, 与b 组相比, NADPH 的反应量明显减少,
说明鱼腥草素同系物对脂肪酸合成酶有抑制作用。该结果表明HP LC 法可
以准确地反映体系中NADPH 实际浓度的变化。3. 4 精密度、方法重现性和标准加入回收率实验
将对照溶液和加酶反应后的样品溶液在4℃下保存, 分别在0、1、4、8、12和24h 进样测定NADPH 少量, 重复6次, 求平均值。得出0, 1, 4, 8, 12和24h 的NADPH 峰面积, 它们的相对标准偏差(RS 1. ,
样品溶液精密度良好。
20 图2 反应体系的HP LC 色谱图
6次, 测定RS D 为1. 78%, 说
Fig . 2 HP LC chr omat ogra m s of system
a . 空白组(blank gr oup ) ; b . 酶对照组(reductase
取50μNADPH 溶液, 测定其含量, 重复3次取contr ol gr oup ) ; c . 抑制剂组(inhibit or gr oup ) ; Peak 1:
NADPH 。平均值。按已得平均值加入NADPH 标准品40、50和
60μmol/L,回收率为98. 9%~10112%, RS D (n =3) 为1. 15%。
表2 样品溶液的精密度
Table 2 Precisi on of sa mp le s oluti on
时间Ti m e (h ) 空白组的峰面积
Peak area of blank (mAU ・s ) Peak area of reductase (mAU ・s ) D ifference of peak area (mAU ・s )
[**************]
[**************]
[**************]
[**************]
[**************]4
[**************]6
酶对照组的峰面积峰面积的减少
3. 5 鱼腥草素同系物对脂肪酸合成酶的影响
表3比较了HP LC 法和紫外法检测对脂肪合成酶活力的影响。用紫外法可以检测出HOU 2C n 对F AS 活力有一定的抑制作用。由于HOU 2C 14和HOU 2C 16的水溶性差, 引起反应溶液混浊, 无法用紫外法检测。此外, 本方法的灵敏度远高于紫外分光光度法。从表3可见, HP LC 法检测出的抑制率与紫外法无明显的区别, 表明HP LC 法测定F AS 活力是完全可行的, 且能消除溶液混浊的干扰。结果发现, 随着HOU 2C n 同系物分子中烷酰基碳原子数的增加, 对脂肪酸合成酶的抑制作用先增强后又减弱; HOU 2C 12
的抑制作用最强。
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分析化学第37卷
表3 鱼腥草素同系物HOU 2C n 对脂肪酸合成酶的抑制率Table 4 I nhibit ory rate of HOU (s odiu m houttuyfonate ) 2C t o F AS
HP LC method
UV s pectr ophot ometry [9]
I nhibit ory rate (%)
\\27. 336. 439. 734. 230. 8
组别Gr oup 空白组B lank
酶对照组Reductase
HOU 2C 8HOU 2C 10HOU 2C 12HOU 2C 14HOU 2C 16
峰面积Peak area
(mAU ・s )
[***********][**************]4
抑制率
I nhibit ory rate (%)
\\24. 432. 128. 3
抑制率
溶液混浊Turbid s oluti on 溶液混浊Turbid s oluti on
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of Fa tty Ac i d Syn tha se of D uck L i ver Ana lyzed by
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XU L i , L I Xue 2Gang , CHE N Zhu , ZHANG Fei , YE Xiao 2L i
1
2
1
2
2
1
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(School of L ief Science, Southw est U niversity, Chongqing 400715)
(Che m istry Institute of Phar m aceutical Resources, College of Phar m aceutical Sciences, Southw est U niversity, Chongqing 400716)
Abstract A high perf or mance liquid chr omat ography method measuring the fatty acid synthase (F AS ) activi 2ty and the effect of HOU 2C n t o F AS activity were established . F AS fr om duck liverwas treated with houttuyfon 2
ate homol ogues (HOU 2C n ) . Then the change in the activity of F AS was deter m ined by HP LC . The op ti m al con 2diti ons of HP LC were as f oll ows:Hypersil C 18colu mn, mobile phase:0. 01mol/Lphos phate buffer (pH 7. 2) 2methanol (80∶20, v/v ) , colu mn te mperature:25℃, fl o w rate:1mL /min, detecti on wavelength:340n m, injecti on v olu me:20μL. The regressi on equati on of HP LC was:A =17754x +123. 3, r =0. 9945. An excellent linearity over the range of 0. 5μmol/L-1. 44mmol/Lwas observed . The HP LC method can be used t o deter m ine the F AS activity with less dosage and high accuracy .
Keywords Houttuyf onate ho mol ogues, fatty acid synthase, activity, hight perfor mance liquid chr omat ography
(Received 25Sep tember 2008; accep ted 8December 2008)