博来霉素水解酶的研究进展
国外医药抗生素分册２００９年第３０卷第４期
・１４５・
・研究进展・
博来霉素水解酶的研究进展
。
镪瑛扬
（中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所，北京１０００５０）
摘要：博来霉素水解酶是生物体内通过脱氨基作用代谢博来霉素的重要酶类。除此之外，博来霉素水解酶还参与抗原呈递，水解老年痴呆ＡＰＰ蛋白和解除硫代内脂同型半胱氨酸的毒性作用。现对博来霉素水解酶的作用特征进行全面的综述。
关键词：博来霉素水解酶；博来霉素族抗生素；抗原呈递；阿尔茨海默病中图分类号：Ｒ９７９．１
文献标识码：Ａ
文章编号：１００１・８７５１１２００９）０４・０１４５－０３
ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｈｅＲｅｓｅａｒｃｈｏｆＢｌｅｏｍｙｃｉｎＨｙｄｒｏｌａｓｅ
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ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆ
（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｏｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅａｎｄ
ＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００５０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｈｙｄｒｏｌａｓｅｉｓ
Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｉｔ
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ｉｍｐｏｒｔａｎｔｅｎｚｙｍｅｔｏｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｂｌｅｏｍｙｃｉｎｖｉａｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎｉｎｏｒｇａｎｉｓｍｓ．
ｉｓａｌｓｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅａｎｔｉｇｅｎｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ，ｈｙｄｒｏｌｙｚａｔｉｏｎｏｆＡＰＰｐｒｏｔｅｉｎｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｄｅｍｅｎｔｉａａｎｄ
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Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｈｙｄｒｏｌａｓｅ；Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ；ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｇｅｎ；Ａｌｚｈｅｉｍｅｅｓｄｉｓｅａｓｅ
自１９６６年发现博来霉素（Ｂｌｅｏｍｙｅｉｎ，ＢＬＭ）以来，作为一线治疗的抗肿瘤药物，博来霉素类抗生素在头颈部癌、鳞癌、淋巴瘤等的治疗中表现出良好的临床疗效。除了引起肺纤维化外，博来霉素类药物不良反应少，不损害骨髓、免疫系统。实际上，博来霉素在体内的疗效或毒不良反应均与博来霉素水解酶（ＢｌｅｏｍｙｃｉｎＨｙｄｒｏｌａｓｅ，ＢＨ）的活性密切相关【１１。ＢＨ使博来霉素脱氨基而失去活性，除此之外，作为细胞内的水解酶类，ＢＨ还参与免疫系统的抗原呈递和水解老年痴呆Ａｐ致病蛋白【２．３１。本文就ＢＨ的研究进展，做一综述。值得一提的是，美国匹斯堡大学药理系ＬａｚｏＪＳ教授的研究组，对ＢＨ的功能进行了系统全面的研究。
ｌ
到１９８９年纯化兔的ＢＨ后才得到确定。从兔的肺中纯化到了ＢＨ，用肽段水解法得到部分氨基酸序列推导出核苷酸序列，然后从基因文库中钓取８３２ｂｐ长的ｃＤＮＡ，发现其中部分序列与半胱氨酸蛋白酶有高度的同源性；另外，用半胱氨酸蛋白酶抑制剂Ｅ６４能抑制兔ＢＨ的活性【４１。
从脑中的表达文库中克隆到了ＢＨ的全长ｃＤＮＡ，ＢＨ的可读框全长１３６８ｂｐ，编码４５６个氨基酸，分子质量为５２５６ｌ，其中Ｃｙｓ－７３、Ｈｉｓ－３７２、Ａｓｎ－３９６为催化活性必须的氨基酸。用ＢＨ的ｃＤＮＡ
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ
ｂｌｏｔ检测到正常人不同组织中均有ＢＨ的表
达。比较不同物种之间核苷酸序列的相似性，人与兔的ＢＨ有９２％的核苷酸序列相同，人与酵母的ＢＨ有４０％的序列相同ｐ】。
ＢＨ基因由１２个外显子和１１个内含子组成，基因的总长度超过３０ｋｂ，对５’端的核瞢酸序列分析发现：ＧＣ含量很高，缺乏转录共有序列ＴＡＴＡ盒和ＣＣＡＡＴ盒，ＢＨ的基因特征与管家基因一致，这可以解释为什么在组织中广泛表达的原因。ＢＨ基因被定
ＢＨ的生化性质
ＢＨ属于半胱氨酸水解酶，根据作用特点，半胱
氨酸水解酶分为３大类：半胱天冬酶（ｃａｓｐａｓｅ）、钙蛋白水解酶（ｃａｌｐａｉｎ）和木瓜蛋白酶（ｐａｐａｉｎ），ＢＨ为木瓜蛋白酶家族的重要成员。在对博来霉素代谢的研究中，发现了该酶的存在，但ＢＨ的具体生化性质，直
收稿日期：２００９．０２．１８
基金项目：中国医学科学院创新团队研究基金。
作者简介：何琪杨，研究员，博士生导师，主要从事分子药理学研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｑ．ｖｈ２０００ｂｊ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｍ．
●
万方数据
・１４６
位在人染色体１７ｑ１１．２区，与多发性神经纤维瘤Ｉ型基因座接近【６１。
从蛋白的三维结构看，ＢＨ与２０Ｓ的蛋白酶体结构相似。但人的与酵母的ＢＨ有明显的区别，本身也不能与ＤＮＡ结合。以２Ａ的分辨率，解析了酵母ＢＨ的蛋白结构，由６个亚单位形成的中空六角形结构，类似于蛋白酶体，酶活性位点在孔道中间，６０个赖氨酸在孔道内部，有利于ＤＮＡ与酶的结合【７１。其中，Ｌｙｓ－２４２、Ｌｙｓ－２４４、Ｌｙｓ－２４５在孔道末端形成带正电荷的环状结构，有利于与带负电荷的核苷酸结合【８１。虽然酵母ＢＨ能与ＤＮＡ结合，但人ＢＨ的结构，内部通道上的氨基酸以负电位能为主ｆ９】，缺乏与ＤＮＡ结合的空间结构。
２
ＢＨ与ＢＬＭ活性和耐药性的关系
在ＢＬＭ治疗肿瘤过程中，只对头颈部癌有很好
的疗效，明显的不良反应是引起肺纤维化，这些药理特性均与ＢＨ的作用密切相关。与其他组织相比较，ＢＨ的含量在肺、皮肤中明显降低。通过分子生物学方法也在小鼠体内，证实ＢＨ与ＢＬＭ代谢的关系。利用基因打靶的方法，敲除小鼠的ＢＨ基因，突变小鼠对ＢＬＭ非常敏感，皮下连续注射ＢＬＭ
１００
ｍｇ／ｋｇ，７ｄ，到第９天，小鼠就已经死亡，而野生型
小鼠仍能健康成活。使用高压液相检测ＢＬＭ－Ａ２在突变小鼠内的代谢变化，并没有检测到脱氨基的代谢产物，表明在小鼠体内，ＢＨ是单一基因【¨。
用ＢＨ的ｃＤＮＡ
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ
ｂｌｏｔ检测人肿瘤组织中
的ＢＨ的表达，对头颈部癌和癌旁正常组织，没有出现一致的表达变化，而在何杰金氏（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ）淋巴瘤中没有检测到表达，这也解释了为什么临床淋巴瘤患者对ＢＬＭ敏感的原因【１０】。用ＢＬＭ治疗３４０例男性胚细胞癌的患者，其中３８例出现肺纤维化；检测ＢＨ的羧基端１４５０位核苷酸的多态性变化，与肺纤维化没有任何联系，说明ＢＨ基因并不能用于预测ＢＬＭ治疗后的肺纤维化出现率【１１１。
临床使用ＢＬＭ过程中，肿瘤患者往往出现耐药性。使用细胞株的实验，并没有发现耐药株中ＢＨ的活性增加。用ｌ
Ｉ－ｔｇ／ｍＬ
ＢＬＭ连续处理人宫颈癌ＨｅＬａ
细胞大约２年，细胞连续传代１５０代后，得到稳定的耐药株，对ＢＬＭ的耐药性是敏感细胞的２０倍。将耐药株接种在裸鼠体内，也可以检测到对ＢＬＭ的敏感性明显降低。但用ＨＰＬＣ并没有检测到ＢＨ的活性增加。使用碱性蔗糖梯度分析发现：耐药细胞的修复损伤ＤＮＡ的能力明显升高｛１２】。另一项研究用ＢＬＭ处理人头颈部扁平癌Ａ２５３细胞，得到３株耐药株，耐药
万方数据
Ｗｏｒｌｄ
Ｎｏｔｅｓ
ｏｎ
Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，２００９，Ｖ０１．３０，Ｎｏ．４
性分别为４、９、２ｌ倍；耐药细胞对ＢＬＭ族的抗生素如ＢＬＭＢ２、ＰＥＰ有交叉耐药性，对长舂新碱、多柔比星没有交叉耐药性。ＨＰＬＣ也没有检测到耐药株代谢ＢＬＭ—Ａ２的活性增加。碱性洗脱分析发现耐药株的ＤＮＡ损伤修复速度明显提高１１３１。
３
ＢＨ水解老年痴呆致病Ａｐ蛋白的机制
阿尔茨黑默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’Ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ），通常
称为老年痴呆症。其发病机制是由于淀粉样前体蛋白（ＡＰＰ）的剪切出现异常的Ａｐ肽段，在神经细胞内积聚产生毒性，导致神经细胞死亡所致【１４】。将ＢＨ基因导入到ＣＨＯ细胞中，使其过度表达，可以提高ＡＰＰ的分泌２倍以上，但体外，ＢＨ并不能降解ＡＰＰ，表明ＢＨ的促进作用是通过间接途径实现的【１５１。通过蛋白的突变分析，可以确定ＢＨ蛋白７３位的半胱氨酸对于剪切ＡＰＰ的活性是必需的［１６】。使用ＨＰＬＣ和质谱法分析ＢＨ所降解的Ａ１３种类，具有相对的特异性，只能水解Ａ１３（３－４２）肽段，在其Ｈｉｓ（１４）－Ｇｌｎ（１５）连接键部位断开【１７】。
由于老年痴呆症的多数病例是散发的，没有家族遗传史，加上目前对该疾病还无有效的治疗药物，通过相关基因预测老年痴呆症的发生就显得尤为重要。１９９８年，首次报道ＢＨ基因的多态性与老年痴呆症的发生有关（３】，引起了广泛的兴趣。后来的对临床患者的检测结果，并没有发现这两者之间的关系，既有对欧洲人的检测，也有对１１０Ｈ中国台湾人的检测，均没有发现ＢＨ基因的多态性与ＡＤ之间的联系［１８－２０】。
４
ＢＨ参与抗原呈递的机制
人体的免疫系统在对付病毒、细菌感染时，通
过对病原微生物的加工，产生抗原的表位，激发特异的免疫反应。而ＢＨ可能参与Ｉ类组织相容性抗原传递通路的调节。通过提取水解酶，体外作用发现ＢＨ和嘌呤霉素敏感的氨肽酶能水解水泡性口炎病毒核蛋白抗原【２１。
尽管上述的研究证明ＢＨ参与了抗原的呈递，但最近的一项更为严格的实验并不支持ＢＨ的这种作用。从缺失ＢＨ基因的小鼠中得到的脾细胞和胚胎成纤维细胞，水解肽段作用与野生型没有区别；用来自缺失２种水解酶ＢＨ、ＰＡ的小鼠细胞，抗原处理作用与野生型也没有区别，只对一种与ＣＤ一８反应有关的抗原有明显差异【２１１。由于小鼠体内有几种水解酶具有相同的作用谱，重叠功能的作用特征使结果的解释充满争议。
国外医药抗生素分册２００９年第３０卷第４期
５
ＢＨ的其他作用
同型半胱氨酸的代谢产物硫代内脂半胱氨酸
（Ｈｅｙ—ｔｈｉｏｌａｃｔｏｎｅ），对人体产生明显的毒性，是心血管和神经退行性疾病的致病因素。人体通过２种机制对硫代内脂半胱氨酸进行解毒，一是通过尿液排出；二是在细胞内脱毒，后者的作用通过何种酶类进行还不清楚。以硫代内脂半胱氨酸作为检测指标，使用生化方法从人的胎盘纯化到了该酶，通过质谱法确定该酶的蛋白序列与ＢＨ相同；另外，从酵母中也纯化到了水解硫代内脂半胱氨酸的酶类为酵母ＢＨ，通过表达ＢＨ重组蛋白，也证实了ＢＨ作用的专一性，说明ＢＨ是一种重要的保护酶类，避免细胞被同型半胱氨酸代谢产物所损伤【２２１。
ＢＨ在细胞内能与酵母泛素缔合酶９的人同源蛋白形成复合物【２３】，这种复合物在细胞内起何种作用，目前仍不清楚。６研究展望
自从发现ＢＨ能代谢ＢＬＭ以来，对其功能进行了系统的研究，不仅阐明了其作用特征，还发现了该酶的其他作用机制，尤其在保护细胞免受同型半胱氨酸毒性的作用，对于其他重大疾病的治疗也具有一定的研究意义。在人体内，ＢＨ除了特异的作用外，还与其他蛋白水解酶一起协同作用，影响药物的体内代谢和生物学功能。因此，加强诸如ＢＨ基因的表达是如何调节之类的基础研究，对于博来霉素族抗生素的临床使用和降低其不良反应，均具有重要的意义。
参
考
文
献
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万方数据
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Ｔ．Ｆｕｒｔｈｅｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ
ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔＨｅＬａｃｅｌｌｓａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｍｅｃｈａｎｉｓｍ田．ＪｐｎＪＣａｎｃｅｒ
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【ｌ３】Ｌａｚｏ
ＪＳ，ＢｒａｕｎＩＤ，ＬａｂａｒｅｅＤＣ，ｅｔａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
ｏｆ
ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆｈｕｍａｎｃｅｌｌｓｕｂｌｉｎｅｓａｎｄｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｉｏｎｏｆｂｌｅｏｍｙｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｂｙｌｉｂｌｏｍｙｃｉｎ【Ｊ】．
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Ｅ，ＳｃｈｗａｒｚｅｎｂａｃｈｅｒＲ，Ｌｉｐｔｏｎ
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ＲＰ，Ｌｅｆｔｅｒｏｖａ
ＭＩ，ｅｔａ１．Ｃｙｓｔｅｉｎｅ７３ｉｎｂｌｅｏｍｙｃｉｎｈｙｄｒｏｌａｓｅｉｓｃｒｉｔｉｃａｌｆｏｒａｍｙｌｏｉｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒ
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Ｃｏｍｍｕｎ，
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Ｈ，Ｉｓｏｂｅ
Ｔ，ｅｔａ１．Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｏｆａｍｙｌｏｉｄ
ｂｅｔａ・・ｐｅｐｔｉｄｅｓｂｙｎｅｕｔｒａｌｃｙｓｔｅｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ
ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｈｙ－・
ｄｒｏｌａｓｅ［Ｊ】．ＰｒｏｔｅｉｎＰｅｐｔＬｅｔｔ，２００６，１３（２）：儿９
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（下转第１７０页）
【１
・１７０
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ｕｓｅ
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Ｒｅｖ
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ａ１．Ｃｌｏｎ・
Ｊ，ｅｔ
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ａ１０８一
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ｅｎ－ｓｅ－
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ｚｙｍｅｄｏｍａｉｎｓｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｓｙｎｔｈａｓｅｓａｎｄｒｅｌａｔｅｄ
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ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ
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Ｄａｔａ
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ａ１．Ｃｏｎ・
ｓｅｃ—
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【１５１ＭａｔｓｕｓｈｉｍａＰ＇ＢｒｏｕｇｈｔｏｎＭＣ，Ｔｕｒｎｅｒ
ＪＲ，ｅｔ
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（上接第１６３页）团强有力地特异性结合以至于高度选择性地烷基化该基团的化合物。这也是目前正在进展中的对蛋白剪接抑制剂进行优化的首要目标。一项研究是利用已知的结核分支杆菌ＲｅｃＡｐ勺含肽的晶体结构来优化在ＨＴＳ中鉴定出的蛋白剪接抑制剂的结合能力和选择性。
逆的抑制剂将通过永久抑制激酶活性而体现出其优越性。这一原则正愈来愈多地应用于设计抗肿瘤药物即蛋白激酶抑制剂之中。
使用如同迈克尔反应受体这样的活性化合物时所面临的挑战是，寻找反应性足够低即不会不加选择地与所有亲核基团反应但却与一个亲核的催化基
万方数据
博来霉素水解酶的研究进展
作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：
何琪杨， HE Qi-yang
中国医学科学院,北京协和医学院,医药生物技术研究所,北京,100050国外医药（抗生素分册）WORLD NOTES ON ANTIBIOTICS2009，30(4)0次
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