纤维素酶产生菌的筛选分离
纤维素酶产生菌的筛选分离
一、 实验目的：
1. 掌握无菌操作的技术
2. 掌握选择培养基的设计和配制
3. 掌握特定菌种筛选方法
4. 掌握菌种鉴定方法
5. 测定菌种生长曲线和纤维素酶的活性
二、 实验原理：
该研究设计性实验是利用纤维素酶产生菌可以分解纤维素酶，故而在含有羧甲基纤维素的平板（pH9.0）上可形成透明圈的原理和筛选纤维素酶产生菌。
三、 实验内容：
(1) 培养基
① 选择培养基的配制
同体培养基：
250mL三角瓶、1.8g营养肉汤、100mL水、pH9.0、2g CNC-Na、2g琼脂、搅拌均匀包扎灭菌
液体培养基：
250mL三角瓶、1.8g营养肉汤、100mL水、pH9.0、2g CNC-Na、2g琼脂、搅拌均匀包扎灭菌（配制2份备用）
② 摇瓶发酵培养基的配制
蛋白胨1.0%、酵母粉1.0%、CMC-Na1.0%、NaCL0.5%、KH2PO4 0.1%，另配10% NaCO3，分开灭菌后与上述培养基成分按1:9的比例混合均匀，使培养基的初始PH为9.5-10
（2）配制筛选平板和斜面培养基
在超净台中将上述培养基倒入平板和试管，试管倾斜放置，待培养基凝固后，低温保存，待用。
（3）菌种筛选
①称取土样10g，用无菌水稀释定容至100mL，将土壤液稀释至 移取150mL土壤悬液到筛选平板A，均匀涂布后于30。C恒温培养箱培养12h.
②待平板A长出单菌落后，用接种环挑取每个单菌落的一半到另一筛选平板C上，作染色鉴定，原来平板B保存于4。C的冰箱中，保藏备用
③ 将用于染色鉴定的筛选平板C于30。C恒温培养1-2d，向培养皿中加入适量1mg/mLa的刚果红溶液，并染色1h;弃去染液，加入适量1mol/L的NaCla溶液，洗涤1h，若细菌产生纤
维素酶，则在菌落的周围会出现清晰的透明圈，依据透明圈的直径大小选择产生酶菌株。
④ 将纯化的产纤维素酶菌株接种到斜面培养，待用。
（4）生长曲线的测定
流程 种子液→标记→接种→培养→测定
① 种子液制备
取大肠杆菌斜面菌种1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入肉膏蛋白胨培养液中，静止培养12h作种子培养液
② 标记编码
取盛有50mL无菌肉膏蛋白胨培养液250mL三角瓶11个，分别标号为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14 、16、20h ③接种培养
用2mL无菌吸管分别准确吸取2mL种子液加入已编号的11个三角瓶中，于37。C下震荡培养。然后分别按对应时间将三角瓶取出，测OD值
④生长量测定
将未接种的肉膏蛋白胨培养基倾倒入比色杯中，选用600nm波长分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从Oh起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种牛肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其OD值在0.10～0.65以内，
经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。
⑤ 结果
将测定的OD值填入下表
以上述表格中的时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制大肠杆菌的生长曲线。
（5）发酵产酶
①将经筛选的单菌落有斜面培养基接种到30mL(205mL的三角瓶)摇瓶发酵培养基中，于摇床37。C，225rpm下培养48h，制成液体菌种。
②然后按1%的接种量将液体菌种加入到50mL(250mL的三角瓶)摇瓶发酵培养基中，在摇床床37。C，225rpm下进行发酵。 ③ 取培养适当时间（具体根据生长曲线制定）的发酵液在高速离心机中进行4。C，8000rpm离心10min，上清液即为粗酶液。
（6）酶活性测定（与测生长曲线可以同步进行）
①标注曲线的绘制（根据实际测定的酶液吸光值，对应该曲线可
以查出相应的酶活力）
分别吸取0.5%标准葡萄溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，分别定容至50mL。
再分别吸取上述溶液各1.5mL于比色管中，各加1.5mL3,5一二硝基水杨酸溶液，煮沸5min（另作1管对照，取1.5mL蒸馏水，加1.5mL3,5一二硝基水杨酸溶液，同样煮沸5min。
冷却后，用分光光度计在540nm波长下比色，以光密度做纵坐标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫摩尔数（酶活力）为横坐标，绘制标准曲线。
②取菌液在8000r/m下离心10min，得到的上清液为酶液。 ④ 取0.1mL酶液（另取0.1毫升酶液在沸水浴中煮20min灭活对照），加入1mL pH=8.04的1%CMC-Na溶液，置于55。C中恒温反应30分钟然后加入1Mldns,在沸水浴中显色10分钟，再加入2毫升水，测540nm吸光度（以灭活的的酶液经同样操作后作为对照）。用葡萄糖做标准液以每小时生成相当于1mg葡萄糖作为一个活力单位U。
（7）菌种鉴定
取筛选平板C的单个菌落，在载玻片上进行革兰氏染色鉴定观察。
（8）菌种保存
①无菌甘油制备
将适量的60%的甘油置于三角瓶中，外加封口膜，121。C，高压蒸汽灭菌20分钟后，备用。
②菌悬液的制备
将菌种培养液（4000r/min），倾去上清液，并用相应的新鲜培养液制备成一定浓度的菌悬液，然后用移液管移取0.5mL菌悬液，置于一支无菌试管中。
③滴加甘油
在上述试管中加入0.5mL60%的甘油，密封无菌试管，并在低温保存。