动物实验技术作业模板
有关褪黑素（MT）与雌激素（E）联合用药对老年性痴呆（AD）
影响的研究
姓名：李XX 学号：XX 专业：XX 联系电话：XX 邮箱地址：XX
国内外研究现状
AD发病机制及其治疗的研究多年来一直地老年医学、神经病学和神经生物学的热点课题。随着AD分子生物学的研究进展，近年来对AD发病的细胞分子机制的理解取得长足的进展。最主要的进展之一是提示了从Aβ（β淀粉样蛋白）的前体蛋白APP的加工—Aβ的生成—Aβ的沉积到SP（老年斑）形成及其伴随的神经元损害的AD病理过程。Aβ由其前体（APP）裂解而来。在生理状态的Aβ是可溶性的，可能具有某种生理功能。病理状态下Aβ为不可溶性，它们聚集和纤维形成，并在神经组织沉积产生毒性作用，在这一过程中机体过氧化（自由基）、糖基化作用、炎症反应起了重要作用，Aβ也主要通过自由基发挥其强的神经毒性作用。脑内有大量Aβ的沉积和SP形成的动物模型也成为模拟AD病理过程的主要模型之一。
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因此，本课题选用以Aβ沉积，老年斑为主要病理改变的PDAPP转基因鼠和加速老化鼠（SAM-P8）作为动物模型，研究褪黑激素和雌激素对动物模型脑内Aβ生成、沉积、老年斑形成等改变及脑内自由基损害的影响，结合行为学研究。分析褪黑激素和雌激素对机体不同年龄阶段老年性痴呆病理过程中的作用，为这二种激素治疗老年性痴呆奠定理论基础。
研究意义
围绕β淀粉样蛋白（Aβ）生成、沉积到老年斑形成这一老年性痴呆（AD）病理机制主线，自由基过氧化损害加速Aβ聚集几神经元调亡的要点，本课题利用褪黑激素…… …… …… …… 研究腿黑激素和雌激素是否有实效性阻止AD的病理过程，抗自由基损害，为探讨褪黑激素和雌激素单一和联合用药防治老年性痴呆的用药奠定理论基础。
拟解决的关键问题
1、 为了褪黑激素、雌激素对Aβ生成、沉积到老年斑形成，拮抗自由基…… …… …… ……从而说明褪黑激素、雌激素是否有时效性干预AD病理进程。
2、 到目前为止仍没有一中老年性痴呆模型能较全面模拟老年性痴呆病理变化和临床表现。PDAPP转基因鼠主要特征为脑内…… …… …… ……及其伴随的神经元损害这一AD病理机制及行为学表现，能更好地反映DSS治疗AD的作用。
本项目的特色与创新之处
本课题围绕Aβ生成、沉积到老年斑形成这一AD病理机制主线，自由基过氧化损害可加速Aβ聚集及神经元调亡的要点，选用褪黑激素和雌激素，研究干扰Aβ的沉积，老年斑形成，神经元调亡，简明…… …… …… ……能不同，研究激素时效性干扰AD病理过程的研究国内外未见有关的报导。
实验方案和技术
（1）AD动物模型筛选
①PDAPP转基因鼠筛选
选用PDAPP转基因鼠的子代鼠，剪鼠尾剪碎匀浆，用PCR技术筛选出含存Happ695双突变基因的小鼠用于实验。
②SAM-P8鼠筛选
直接选用SAM-P8鼠子代用于实验。
（2）实验分组
实验又分为褪黑激素组（MT组）、雌激素组（ET组）、联合组和对照组4个组，各组30只动物。
① MT组：皮下注射MT 1mg/kg(时间： 10:00pm)，30只动物。
② ET组：颈部皮下植入可持续释放60天的含1.7mg雌二醇（ET），60天后再植入一
个，30只动物。
③ 联合组：皮下注射MT 1mg/kg(时间： 10:00pm)和颈部皮下植入可持续释放60天的
含1.7mg雌二醇（ET）60天后再植入一个，30只动物。
④ 对照组：分为MT组、ET组、联合组的对照组，各小组10只动物，MT组的对照
组皮下注射生理盐水，ET组的对照组植入含等量胆固醇的安慰剂，联合组的对照组注入生理盐水和含等量胆固醇的安慰剂。其他处理方法同各实验组。
（3）激素治疗时间
A、MT组、ET组分别在动物1月龄、4月龄、8月龄时用激素进行治疗，分别治疗4个月。
B、联合组分三个时间组合分别注射褪黑激素和雌激素，第一组合为褪黑激素和雌激素分别在1月龄、4月龄时注射，第二组合分别4月龄、8月龄时注射，第三组合在8月龄时注射。用药4个月。
C、对照组不进行激素治疗。
所有动物饲养到12个月龄时进行一下处理
（4）SAM-P8鼠和PDAPP转基因鼠认知能力测定
所有动物饲养到12个月龄时用Morris水迷宫测定。
指标：①空间探索试验——平均逃避潜伏期。
②定位航行试验——平台象限游泳距离百分比和穿环次数。
（5）PDAPP转基因鼠脑内APPmRNA、APP、Aβ检测
小鼠处死立即取出大脑组织，均浆后进行一下测定
APPmRNA测定：取大脑均将组织用荧光定量RT-PCR方法检测各组APPmRNA含量。 APP测定：取大脑匀浆组织用Wester印迹法检测各组APP含量。
可溶性Aβ测定：用大脑匀浆组织离心后去上清液，用ELISA法检测各组可溶性 Aβ1-40和Aβ1-42含量。
（6）SAM-P8鼠和PDAPP转基因鼠脑内淀粉样颗粒检测
常规光镜固定、取材，取出的大脑组织，各组织作冠状冰冻连续切片，用Gomori六胺银法（Grocott改良法）染色和免疫组化染色，在光镜下观察前额皮质、海马、内侧隔核、斜角带核的Aβ沉积，图像分析系统定量分析Aβ数量。
（7）PDAPP转基因鼠老年斑的分析
常规电镜固定、取材、切片和染色，电镜下观察前额皮质、海马、内侧隔核、斜角带核的老年斑数量和形态结构。
（8）PDAPP转基因鼠自由基损害分析
小鼠处死立即取出前额皮质、海马、基底前脑，匀浆后去上清液，进行以下测定。 自由基测定：将样品注入平板玻璃管中，用BrukerRCS106电子顺磁共振仪（EPR）检测自由基，用相对强度表示，RI=峰值×（波宽）2
SOD、MDA的含量测定：硫代巴比妥酸法测定MDA的含量；Xan-Xan氧化酶系统法测定SOD活性。
（9）SAM-P8鼠大脑组织形态学观察
常规光镜固定、取材，取出的大脑组织，各组织作冠状冰冻连续切片，切片逢6取3，随机取相邻的切片分为3套，分别作ChAT免疫组化染色、AchE组织化学和尼氏染色。在光镜下观察前额皮质、海马、基底前脑，图像分析系统定量分析。
观察指标：
① 前额皮质、海马CA1区、齿状回神经元数量。
② 内侧隔核、斜角带垂直支胆碱能神经元数量。
③ 前额皮质、海马CA1区、齿状回胆碱能神经纤维数量。
预期结果
（1） 预期证实褪黑激素、雌激素联合用药比单一用药有更强的抑制Aβ沉积、老年
斑形成，拮抗自由基损害。也可能得到褪黑激素、雌激素可分解已形成的老年
斑作用。
（2） 预期研究结果能表明褪黑激素、雌激素治疗AD作用是否时效性作用有关。为
褪黑激素、雌激素治疗老年性痴呆奠定理论基础。
研究成果将以论文的形式发表在国内外的杂志（6～8篇）。
可行性分析
（1） 本课题组自1987年开始闹衰老及老年性痴呆的方面的研究，已获本研究方
向国家自然基金资助4项，并有多篇文章发表，其中，申请者2001年《当
归芍药散抗衰老作用的松果体机制探讨》获国家自然科学基金资助，现已
完成。2004年《当归芍药散对β淀粉样蛋白生成、沉积到老年斑形成过程
中的多位点抑制机制》再次获国家自然科学基金资助，研究工作进展顺利，
上述课题研究工作与本次申请的课题从技术方法和研究方向均密切相关，
为完成本课题打下良好基础。
（2） 本课题所用的大部分方法和技术包括六胺银染色、电镜技术、PCR技术、
Aβ纤维荧光检测、Morris水迷宫行为测试等本课题在以前研究中已用到，
并有文章发表。
（3） 我们在学校实验动物中心帮助下已成功引进PDAPP转基因鼠。一向北京
大学实验动物中心订购一批SAM-P8鼠，保证了本研究的动物来源。
（4） 本课题组大部分成员有博士、硕士学位，较年轻，均从事老年医学研究多
年，学校中心实验室为完成本课题提供良好的设备和实验条件，因此完成
此课题在技术方法、人员安排、实验条件上是可行的。
参考文献
（1）Schenk-D; Barbour-R; Dunn-W.Immunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer disease like pathology in the PDAAP mouse. Nature, 1999; 400(6740): 173-7
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